초록 ▼

식용달팽이에서 새로운 글리코사미노글리칸류 (GAG)인 아카란 황산을 이용하여 헤파린의 구강투여에 대한 연구를 하는 과정에서 Bacteroides stercoris HJ-15 GAG 분해효소를 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 B. stercoris HJ-15부터 헤파린 분해효소, 아카란황산 분해효소와 콘드로이틴 분해효소를 정제하고 특성을 규명하며 또한 유전자 클로닝과 발현을 시도하고자 한다. 또한, Bacteroides thetaiotaomicron의 GAG lyases 들의 발현 및 정제를 시도한다. 이러한 결과는 헤파린 및

식용달팽이에서 새로운 글리코사미노글리칸류 (GAG)인 아카란 황산을 이용하여 헤파린의 구강투여에 대한 연구를 하는 과정에서 Bacteroides stercoris HJ-15 GAG 분해효소를 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 B. stercoris HJ-15부터 헤파린 분해효소, 아카란황산 분해효소와 콘드로이틴 분해효소를 정제하고 특성을 규명하며 또한 유전자 클로닝과 발현을 시도하고자 한다. 또한, Bacteroides thetaiotaomicron의 GAG lyases 들의 발현 및 정제를 시도한다. 이러한 결과는 헤파린 및 헤파란 황산의 구조를 규명하는데 매우 유용하게 사용될 수 있으며. 이러한 연구를 통해서 장내에 있는 미생물의 GAG lyase의 역할과 구강 투여 헤파린의 생체 이용성에 관해 새로운 정보를 얻고자 한다.
1)Bacteroides stercoris HJ 15 헤파린 분해효소, 콘드로이틴 황산, 아카란황산 분해효소 정제 및 클로닝
2) 아카란황산 및 아카란황산의 올리고당 제조
3) 아카란황산 결합단백질의 분리 및 정제
4) 아카란황산 유래 올리고당의 Helicobacter pyroli의 부착저해 효과
5) 합성된 primer를 이용하여서 template DNA로 Bacteroides thetaiotaomicron의
genomic DNA를 사용 하여서 PCR 수행, 위의 방법으로 다량의 헤파린 분해 효소의 유전자만을 증폭. PCR을 통해서 얻은 헤파린 분해 효소의 유전자를 ligation 반응을 통해서 expression vector에 삽입. 위의 과정을 통해서 제작된 헤파린 분해 효소의 유전자를 가지는 expression vector의 최적의 발현 조건 확립. 최적의 발현 조건 하에서의 재
조합 헤파린 분해 효소 발현. Flavobacterium과 Bacteroides stercoris HJ-15의 헤파
린 분해효소들과 물리 화학적 성질의 비교 및 기질 특이성 비교 (헤파린, 황산 헤파란, 황산 콘드로이틴 등)
Bacteroides stercoris HJ 15
1) Heparin lyase I, II, III의 분리 정제
Bacteroides stercoris HJ-15로 부터 DEAE-Sephadex column, gel filtration
column, hydroxyapatite column, CM-Sephadex C-50 column chromatography
를 시행하여 heparin lyase I, II, III을 분리 정제하였다. SDS-PAGE를 수행한 결과
이 heparin lyase I의 분자량은 48,000 Da이었으며 heparin lyase II는 분자량이 83,000 Da, heparin lyase III는 70,000이었다.
2) Chondroitin lyase ABC 및 AC의 정제
같은 방법으로 정제하여 chondroitin lyase ABC의 분자량은 116,000, chondroitinlyase AC는 84,000이었다.
Bacterpoides thetaiotaomicron HJ 15
3) Heparin lyase I, heparin lyase III, Chondroitin lyase ABC, AC의 발현
및 정제 PCR을 이용하여 증폭 시킨 후 pET vector에 클로닝을 하여 E. coli에서 발현을 시
켰다. heparin lyase I, heparin lyase II, chondroitin lyase ABC, AC를 발현 후
soluble 및 inclusion body 형태로 발현 된 후 refolding 과정을 거쳐서 정제하여
각각의 효소를 얻을 수 있었다.

Abstract ▼

First, this research is to mainly focus on the characterization and molecular
cloning of heparin lyases and chondroitin sulfate lyases from Bacteroides
stercoris HJ-15. Second, expression and purification of glycosaminoglycan
lyases from Bacteroides thetaiomicron. Third, a variety of differ

First, this research is to mainly focus on the characterization and molecular
cloning of heparin lyases and chondroitin sulfate lyases from Bacteroides
stercoris HJ-15. Second, expression and purification of glycosaminoglycan
lyases from Bacteroides thetaiomicron. Third, a variety of different size of
oligosaccharides in the range from disaccharide to tetradecasaccharide of
acharan sulfate will be prepared by partial enzymatic digestion. This study
should provide the opportunity to learn how acharan sulfate interacts with
bioactive proteins such as growth factors and vitronectin to regulate important
biological events in tumor cells.
While we are studying the metabolisam of acharan sulfate, polysaccharide lyases
that can degrade glycosaminoglycans (GAGs) were identified in an anaerobic strain
living in the human intestine. The strain was isolated from the stool of a healthy
male and identified as Bacteroides sp. strain HJ-15. A detailed taxonomical study
indicated the species is a strain of Bacteroides stercoris The isolate was cultured
and the polysaccharide lyases were purified. These enzymes could act on GAGs
containing either glucosamine or galactosamine suggesting the presence of both
heparinases and chondroitinases. These studies demonstrated the presence of at
least two types of polysaccharide lyases: heparin lyase and chondroitin sulfate lyase.
The eliminative mechanism of these lyase enzymes was confirmed through the
isolation of unsaturated disaccharide products. The heparin lyase acted on both
heparin and acharan sulfate. The Bacteroides chondroitin lyase, acted on chondroitin
sulfates A, B (dermatan sulfate), and C, resembling chondroitin lyase ABC. Each
enzyme has been purified to homogeneity by a combination of ion-exchange,
hydroxyapatite, and gel-filtration chromatographic steps. The molecularweights of
heparinase I, heparinase II (acharan sulfate lyase), heparinase III, chondrotitinase
ABC, and chondrotinase AC were determined as 48, 83, 70, 116, and 84 kDa by
SDS-PAGE, respectively. Their physicochemical properties were characterized and
compared from Flavobacterial enzymes.
Very recently, the complete 6.26-Mb genome sequence of the Gram-negative
anaerobe, Bacteroides thetaiotaomicron, which is a predominant member of the
normal human distal small intestinal and colonic microbiota, has been reported. The
glycosaminoglycan degrading enzymes were cloned into the EcoR I/Xho I sites of
plasmid pET. The recombinant heparin lyase I, heparin lyase III, chondroitin sulfate
lyase ABC and chondroitin sulfate lyase AC were expressed in Escherichia coli using
the T7 polymerase pET expression system. The recombinant glycosaminoglycan
degrading enzymes were purified to homogeneity by combinationof
DEAE-Sepharose, CM-Sephadex C-50 and Ni-affinity column chromatography. A
milligram quantity of each enzyme could be obtained in a 1 L culture.
This study should provide the opportunity to learn how
glycosaminoglycan including acharan sulfate interacts with bioactive proteins
such as growth factors and vitronectin to regulate important biological
events in tumor cells. It will be very important to identify and characterize
the acharan sulfate molecule that has these activities. Ultimately these
studies could lead to the development of pharmaceutical agents for cancer
therapy that have specific activities that support homeostasis and will
enhance our knowledge of the interaction of glycosaminoglycans and protein

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문...4
• 2. 영문요약문...5
• Ⅲ. 연구내용 및 결과...6
• 1. 서론...6
• 2. Part I...10
• 2. 연구방법...11
• 3. 결론...30
• 4. 참고문헌...32
• 3. Part II...34
• 1. 서론...35
• 2. 연구 방법...35
• 3. 실험결과...38
• 4. 결론...50
• 5. 인용문헌...50
• 4. Part III...53
• 1. 서론...54
• 2. 연구방법...54
• 3. 결과 및 고찰...60
• 5. 참고문헌...70
• 5. Part IV ...71
• 1. 서론...72
• 2. 실험 방법...72
• 3. 실험재료...72
• 4. 결과...74
• 5. 결과...76
• 6. Part V...77
• 1. 서론...78
• 2. 실험방법...79
• 3. 결과...80
• 4. 참고문헌...81
• 7. Part VI...83
• 1. 아카란황산의 친화크로마토그라피...84
• 2. 결합단백질의 아미노산 서열분석 및 단백질은행의 데이터베이스와 비교...84
• 3. 고찰...85
• IV. 결론...86