보고서 정보
주관연구기관 |
전남대학교 Chonnam National University |
연구책임자 |
백경환
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2004-05 |
과제시작연도 |
2003 |
주관부처 |
과학기술부 |
사업 관리 기관 |
한국학술진흥재단 Korea Research Foundation |
등록번호 |
TRKO200900069792 |
과제고유번호 |
1350018579 |
사업명 |
지역대학우수과학자지원 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
세로토닌유도체.타이라민유도체.세포벽 강화.p-coumaroylserotonin.형질전환 벼.2차대사.feruloylserotonin.cinnamic acid.고추.serotonin derivatives.tyramine derivatives.cell wall fortification.p-coumaroylserotonin.transgenic rice.secondary metabolism.feruloylserotonin.cinnamic acid.Capsicum annuum.
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초록
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식물체 방어 기작, 특히 세포벽 강화와 관련되어 있다고 알려진 hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl)transferase[THT] 유전자를 고추에서 클로닝하고, in vitro 와 in vivo 에서의 특징을 규명한후, 벼에 형질전환 하여 효소활성을 검증하고, 그 생합성 화합물 변화와 효과를 분석한다.
고추에 UV를 조사한뒤 분자생물학적 방법을 이용해 THT clone을 클로닝하였고, 대장균에 형질전환 하여 그 단백질을 정제한 뒤 효소의 기질특이성을 규명 하였다. 그 후 Ag
식물체 방어 기작, 특히 세포벽 강화와 관련되어 있다고 알려진 hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl)transferase[THT] 유전자를 고추에서 클로닝하고, in vitro 와 in vivo 에서의 특징을 규명한후, 벼에 형질전환 하여 효소활성을 검증하고, 그 생합성 화합물 변화와 효과를 분석한다.
고추에 UV를 조사한뒤 분자생물학적 방법을 이용해 THT clone을 클로닝하였고, 대장균에 형질전환 하여 그 단백질을 정제한 뒤 효소의 기질특이성을 규명 하였다. 그 후 Agrobacterium을 이용하여 벼에 형질전환 하고, Southern, Northern, Western blot을 통해 유전자의 삽입과 발현을 확인하였다. 확인된 형질전환 각 세대 식물체는 포장에서 생육시켜 세대별 종자를 보전함과 동시에 homozygous 계통을 선발하고 계통별 생육특성을 알아보았다. 형질전환 벼 내에서의 효소활성은 HPLC을 이용하여 검증하였고, 그 후 THT 효소의 생성물의 생합성 정도를 조사하였다. 무처리 대조구와 tyramine등 효소의 기질을 공급해준 처리구로 나누어 가각 hydroxycinnamoyl amine의 생합성양을 비교하여 조사하였다. 또한 기질처리시에 발견된 THT 효소의 또 다른 생성물을 규명하기 위하여 일본 교토대학 Ishihara 박사 연구팀에 분석을 의뢰하였고 지금까지 밝혀지지 않았던 THT유전자의 새로운 기질에 대한 특이성을 규명하게 되었다.
지금까지 주로 감자와 담배에서 클로닝하고 연구 되어온 식물2차대사 경로의 한효소인 hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl) transferase [THT]를 고추에서도 클로닝하고 그 염기서열을 밝혔으며, 감자와 담배의 아미노산 서열과 비교 분석되어, 쌍떡잎 식물에 있어 또 하나의 THT 효소를 밝혀 내었다. 정제한 재조합 THT단백질은 종래의 것과 비슷하게 넓은범위의 acyl donor(cinnamoyl-CoA, feruloyl-CoA등)와 acceptor(tyramine, octopamine등)를 기질로 취하였다. 또한 이 효소는 고추내에서 UV라든지 상처등 외부자극이 있었을 때 와 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 과육등 고추의 각 기관에서 발현되고 있음을 확인하였다. 고추 THT유전자 클론을 이용하여 벼에 형질 전환한 결과 낙동과 동진벼에 있어 각각 homozygous한 계통 6개, 2개씩을 $T_4$세대까지 확보해 놓은 상황이다. 이들의 포장 생육특성을 조사한 결과 재배종 벼에 비하여 전반적으로 초장이 줄어들었으나 그 수확량도 감소하여 단간화 된 벼로 육성되었다고 단언 할 수는 없었다. 또한 흰잎마름병, 도열병 등에도 크게 저항성을 나타내지는 않아 THT 유전자에 의한 직접적인 세포벽 강화와 그에 의한 생리적 효과가 뚜렷 하다고는 볼 수 없겠다. 그러나 tyramine, cinnamic acid등 THT 효소의 기질을 뿌리를 통하여 처리해준 형질전환 벼에서 다량의 hydroxycinnamoyl amine이 검출되었고 이는 결국 p-coumaroylserotonin 과 feruloylsetotonin 으로 확인되었다. 이 효소의 serotonin에 대한 기질 특이성를 조사한 결과 tyramine에 비해 그 친화도가 월등히 높은 것으로 나타나 실상 이는 hydroxycinnamoyl-CoA: serotonin N-(hydroxycinnamoyl)transferase[SHT] 이며, 종래의 THT에서는 기질로 알려지지 않은 serotonin을취하여 p-coumaroylserotonin, feruloylserotonon 을 생합성 함을 밝혔다.
Abstract
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Hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl)transferase[THT]which is associated with plant defense mechanism, especially cell wall fortification, is cloned from Capsicum annuum and characterized the enzyme kinetics in vitro and in vivo. Transgenic rice expressing the THT gene is generated , in
Hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl)transferase[THT]which is associated with plant defense mechanism, especially cell wall fortification, is cloned from Capsicum annuum and characterized the enzyme kinetics in vitro and in vivo. Transgenic rice expressing the THT gene is generated , in vivo enzyme activity is examined, and the production of hydroxycinnamic acid amides is analyzed.
The cDNA encoding THT was cloned from the leaves of UV-C treated Capsicum annuum and the recombinant pepper THT enzyme was purified using a bacterial overexpression system. Enzyme kinetics was examined with this purified enzyme. Transgenic rice plants were engineered to express a THT from pepper and then, insertion and expression of THT gene were confirmed through the Southern, Northern and Western blot. Individual transgenic plants were grown at field, measured the agronomic characteristics and we selected the homozygous lines and saved the seeds of each generation. We analyzed the enzyme activity and products of transgenic rice with HPLC system. We also investigated two transgenic groups, control and substrate treated sample, and found the unidentified products from treated plants, those compound were examined by the 채재가 with Dr. Ishihara group.
One of plant secondary metabolic enzymes, Hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl) transferase [THT], mainly studied in solanaceous plnats, was also cloned from pepper. It is a new type of THT enzyme in dicotyledonous plants. The purified THT enzyme had a broad substrate specificity including acyl donors and acceptors. The THT mRNA was strongly induced upon UV and wounding treatments, and THT expression was detected in leaf, root, stem, flower and fruit. Transgenic rice plants were engineered to express a THT from pepper, and we secured six and two homozygous lines in Nakdong and Dongjin cultivar, respectively. In agronomic characteristics, average height was shortened but grain yield was also decreased, and there were no significant resistance to bacterial leaf blight and blast disease. So it was unlikely that there was obvious physiological effect by cell wall fortification. But, we found the two novel compounds from transgenic rice plants grown in the presence of amines or phenolic acids, and those were identified as p-coumaroylserotonin and feruloylserotonin. Purified recombinant pepper N-(hydroxycinnamoyl)transferase exhibited a serotonin N-hydroxycinnamoyl transferase (SHT) activity, synthesized p-coumaroylserotonin and feruloylserotonin in vitro, and demonstrated a low Km for serotonin.
목차 Contents
- Ⅰ. 연구계획 요약문...3
- 1. 국문요약문...3
- Ⅱ. 연구결과 요약문...4
- 1. 국문요약문...4
- 2. 영문요약문...5
- Ⅲ. 연구내용...6
- 1. 서론...6
- 2. 연구방법 및 이론...7
- 3. 결과 및 고찰...10
- 4. 결론...18
- 5. 인용문헌...20
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