초록 ▼

TPEF의 methylation에 의한 불활성화를 확인하며 methylation pattern과 발현양의 상관관계를 조사하고 TPEF에 대한 polyclonal antibody를 제작하여 cancer의 진단에 응용하고자 한다.
TPEF 유전자가 암에서 비정상적인 메칠화에 의해 불활성화됨을 확인하기 위해서 간세포암, 폐의 편평상피세포암, 폐선암조직과 세포주를 이용해 methylation pattern 과 mRNA 발현량의 상관관계를 조사하고자한다. TPEF의 발현이 없거나 비정상적으로 적은 세포주를 대상으로 5-aza-2'-de

TPEF의 methylation에 의한 불활성화를 확인하며 methylation pattern과 발현양의 상관관계를 조사하고 TPEF에 대한 polyclonal antibody를 제작하여 cancer의 진단에 응용하고자 한다.
TPEF 유전자가 암에서 비정상적인 메칠화에 의해 불활성화됨을 확인하기 위해서 간세포암, 폐의 편평상피세포암, 폐선암조직과 세포주를 이용해 methylation pattern 과 mRNA 발현량의 상관관계를 조사하고자한다. TPEF의 발현이 없거나 비정상적으로 적은 세포주를 대상으로 5-aza-2'-deoxycytidine(5-AzaC) 처리를 통한 재발현을 유도하여 methylation에 의한 불활성화임을 확인한다. 또한 다수의 시료에서 TPEF의 methylation을 조사하는 방법으로 bisulfite처리 후 제한효소 BstUI을 이용한 COBRA assay 방법을 확립하고자한다. 그리고 Bisulfite 처리 후 sequencing을 통해 TPEF 내의 CpG sites에서 정확한 methylation 분포를 분석하고자한다. 이에 병행하여 PCR-LOH, PCR-SSCP를 실시하여 유전적 변이를 조사한다.
본 연구진의 이전 연구 결과 간암에서 정상과 다르게 methylation에 변화가 일어 난 novel hypermethylated fragment로부터 TPEF 유전자를 찾았고 이 TPEF 유전자가 methylation에 의해 간세포암, 폐의 편평상피세포암, 폐선암에서 불활성화됨을 밝히고 BstUI을 이용한 COBRA assay법을 확립하여 손쉬운 methylation pattern 분 석법을 확립하였다. 그리고 COBRA assay, bisulfite sequencing, RT-PCR 등을 통하여 methylation pattern과 발현량의 상관관계를 조사하여 발현에 영향을 미치는 CpG site를 확인하였다. COBRA assay법을 이용하여 CpG site의 methylation 분석 결과 간세포암에서 71% (10/14), 폐의 편평상피세포암에서 80% (12/15), 폐선암에서 17% (1/6) 그리고 간세포암 유래의 세포주에서 모두 methylation 있음을 알았다. 시료의 수가 적기는 하지만 조직과 세포주에서의 methylation 차이는 transarterial embolization(간동맥결찰술)에 의한 조직 괴사로 인한 것으로 사료된다. PCR-LOH는 조사한 간세포암 36% (5/14), 폐의 편평상피세포암에서 7% (1/15)는 LOH가 또다른 1례에서는 homologous deletion이 관찰되었고 폐선암 6례에서는 LOH가 관찰되지 않았다. 흡연등과 같은 발암물질에 직접적인 영향을 받는 편평상 피세포암이 환경적요인과는 비교적 거리가 먼 폐선암이 다른 결과를 보인 것은 흥미로운 사실이었다. PCR-SSCP 분석을 실시한 결과 조사한 간암 14례, 폐암 21례, 간세포암세포주 8례 등 모두에서 돌연변이가 관찰되지 않았음을 알 수 있었다.
이상의 연구결과 COBRA assay방법을 이용한 다수의 시료로부터 methylation pattern 확인 방법을 확립하게 되었고 이 방법을 이용하여 임상진단에 활용할 수 있을 것으로 기대 된다.

Abstract ▼

To investigate the relationship between hypermethylation and inactivation of TPEF gene expression and expression of TPEF gene expression. To apply TPEF antibody to diagnose on clinical samples.
We will investigate inactivation of TPEF gene expression in hapatocellular carcinoma, lung squamous car

To investigate the relationship between hypermethylation and inactivation of TPEF gene expression and expression of TPEF gene expression. To apply TPEF antibody to diagnose on clinical samples.
We will investigate inactivation of TPEF gene expression in hapatocellular carcinoma, lung squamous carcinoma cell, non small cell lung cancer, renal cell carcinoma clinical samples and several tumor cell lines by aberrant hypermethylation. We will confirm this inactivation by abberrant hypermethylation can be reversed by using demethylating agent, 5-aza-2'-deoxycytidine. We will establish the COBRA assay which combined bisulfite modification and BstUI restriction enzyme treatment, can be used in large scale methylated regions screening. We will reconfirm the methylation by sequencing after bisulfite modification. We also will investigate the genetic mutation in several clinical tumor sample and cell lines by using PCR-LOH and PCR-SSCP.
Finally we will make polyclonal antibody against TPEF which able to be used in diagnosing variety tumor samples.
We established COBRA assay which combined bisulfite modification and BstU1 restriction enzyme treatment. By using this assay we found that several clinical tumor sample such as hepatocellular carcinoma, lung squamous carcinoma cell, non small cell lung cancer, renal cell carcinoma are hypermethylated than adjacent normal tissues.
We had a knowledge of the relationship between methylation pattern and expression level of TPEF gene by COBRA assay, bisulfite sequencing and RT-PCR. Inactivated expression of TPEF gene not by mutation such as, deletion and point mutation but by methylation was reversed by demethylating agent, 5-aza-2'-deoxycytidine in tumor cell linses. Parallel with this assay, PCR-LOH, PCR-SSCP served information of deletion mutation and point mutation respectively, in several clinical tumor samples and cell lines.
We tried to make polyclonal antibody against TPEF but it showed many non-specific bands. To apply TPEF antibody on clinical samples to diagnose tumor, more specific and effective epitope screening should be needed.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문...4
• 2. 영문요약문...5
• Ⅲ. 연구내용 및 결과...6
• 1. 서론...6
• 2. 연구방법 및 이론...8
• 3. 결과 및 고찰...11
• 4. 결론...20
• 5. 인용문헌...21