초록 ▼

지금까지 인간에 필요한 생물 유래 유용물질을 대량으로 확보하기 위하여, 돌연변이 및 유전자 조작 등을 통하여 개량된 미생물을 이용하였다. 그러나 현재 생물공학 산업에 사 용되는 균주들은 성장에 필요한 유전자군 외에 진화과정에서 새로운 환경에 적응하기 위 하여 외부에서 획득한 불필요한 유전자군을 많이 포함하고 있다. 이와 같은 불필요한 유 전자 군의 유지 및 발현으로 세포내 에너지원이 과도하게 사용되고 필요 없는 물질도 생 산되므로, 균주에 많은 부담을 주어 균주의 생산성이 크게 저하될 뿐 아니라 제품의 분 리?정제의 효율도 낮아 생

지금까지 인간에 필요한 생물 유래 유용물질을 대량으로 확보하기 위하여, 돌연변이 및 유전자 조작 등을 통하여 개량된 미생물을 이용하였다. 그러나 현재 생물공학 산업에 사 용되는 균주들은 성장에 필요한 유전자군 외에 진화과정에서 새로운 환경에 적응하기 위 하여 외부에서 획득한 불필요한 유전자군을 많이 포함하고 있다. 이와 같은 불필요한 유 전자 군의 유지 및 발현으로 세포내 에너지원이 과도하게 사용되고 필요 없는 물질도 생 산되므로, 균주에 많은 부담을 주어 균주의 생산성이 크게 저하될 뿐 아니라 제품의 분 리?정제의 효율도 낮아 생산제품의 경제성이 크게 떨어졌다. 지금까지는 불필요한 유전 자군의 존재를 알고도 이들의 유전체상의 정확한 위치와 기능 등의 유전정보 부족으로, 시행착오적으로 변이된 유전자를 세포에 그대로 둔 채 대사경로를 조절하여, 균주의 개량 및 생산성 향상에 한계가 있었다. 그러나 최근 여러 종류 생물체의 유전체 염기서열이 완전히 밝혀지고 이에 따른 post-genome시대 연구로 유전자의 기능분석 연구가 급진적으로 진행되고 있어 불필요한 유전자군의 탐색 및 선택적 제거를 통한 대사공학적으로 가장 효율적이면서 정확한 특성 을 갖는 새로운 산업용 인공 균주의 개발이 가능해졌다. 본 연구에서는 현재 유전체 염기 서열이 완전히 밝혀졌고 그 기능도 대부분 알려진 대장균의 유전체를 선택적으로 조절하 여 주어진 대사여건에 불필요하거나 관여하지 않는 유전자 군을 제거하고 유용 목표물질 의 생산에 필요한 유전자군 만으로 구성된 최소화된 새로운 인공균주를 개발하여 생물공 학산업에 필요한 기반을 제공하고자 한다. 이와 같은 최소화된 고성능 인공대장균 개발을 위하여 주어진 환경에서 불필요한 유전 자군을 DNA chip 및 proteomics 분석 결과를 이용하여 선별?확인하고, 이들을 Cre/loxP 및 Flp/FRT에 의한 site-specific recombination, I-SceI에 의한 double-strand breakage repair mechanism 및 homologous recombination과 같은 유전체 조작 기술들로 제거하여, 유전체의 크기는 최소화되었으나 생육에 저해가 없고 보다 향상된 기능을 부여 하여 새로운 산업용 인공균주를 개발하고자 한다.

Abstract ▼

For many years, industrial microorganisms have been improved by conventional mutation methods combined with recombinant DNA techniques for the production of valuable biomolecules. However, these approach have reached limitation in increasing the productivity of industrial microorganisms. The strains

For many years, industrial microorganisms have been improved by conventional mutation methods combined with recombinant DNA techniques for the production of valuable biomolecules. However, these approach have reached limitation in increasing the productivity of industrial microorganisms. The strains being used in the bioindustry, in addition to the genes essential for growth, have exogenously acquired many currently unnecessary genes that were once needed for the adaptation to new environments during the course of evolution. The maintenance and expression of these unnecessary genes has been attributed to excessive energy consumption and unnecessary production of many by-products, which in turn affects negatively the cost-effectiveness of production by decreasing the production efficiency of the microorganism and complicating the purification of the final product. Although the existence of these unnecessary genes has been predicted for a long time, the strain improvement through gene manipulation has been limited by the lack of information on the sequences and functions of the genes. Therefore, most of the strain improvement in bioindustry had to be accomplished by a reiterative trial and error process which resulted in partial disruption of genes without complete elimination of the unnecessary target genes. The recent completion of genome sequencing of many microorganisms, post-genomic research, or bioinformatics has accelerated researches in microbial functional genomics. Now, with the help of microbial functional genomics and novel genome engineering techniques, it is possible to precisely identify, locate, and eliminate the unnecessary genes for the construction of new strains with desired characteristics. This research is aimed at engineering new microbial strains containing a minimal set of genes with robust characteristics, which will lead to the construction of artificial microbial with defined characteristics and higher production efficiency.

목차 Contents

• 제1장 연구개발과제의 개요...15
• 제 1 절 연구개발의 개요...16
• 제 2 절 연구 개발의 필요성...17
• 1. 연구개발의 기술 경제 사회적 필요성...17
• 제2장 국내외 기술개발 현황...23
• 제 1절 국외 기술 동향 및 수준...23
• 제 2 절 국내의 기술동향 및 수준...24
• 제 3 절 현 기술상태의 취약성...25
• 제 4 절 앞으로의 전망...25
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...24
• 제 1 절 E. coli 생육에 불필요한 유전자 선별 및 확인...26
• 1. DNA chip를 이용, 특정조건하에서 유전자의 발현 여부 조사...26
• 2. 영양배지 및 최소영양배지에서 선택적 발현 유전자 탐색...26
• 3. 미생물 유전체 Database를 이용한 유전체 제거 구간 선택...28
• 제 2 절 유전자 및 유전체 부분 제거기술 개발...30
• 1. Cre/loxP 및 Flp/FRT excision system을 이용한 유전자 제거에 필요한 벡터...30
• 2. λ-Red recombination 기법...31
• 3. I-SceI을 이용한 Double Strand Breakage(DSB)를 통한 유전체 제거...32
• 4. λ-Red recombination 과 I-SceI을 이용한 Double Strand Breakage(DSB)를 통 한 markerless deletion system...33
• 5. 최단시간에 선택된 유전체 부위를 신기능 유전자군의 cassette로 대치하는 방법 개발...34
• 제 3 절 유전체 제거기술을 이용한 대장균 유전체의 특정 기능 유전자군의 제거...35
• 1. Cre/loxP recombination system을 이용한 대장균 유전체 제거...35
• 2. λ-Red recombination을 이용한 대장균 유전체의 거대 부위 제거...38
• 3. Biofilm-deficient E. coli 제조...39
• 4. Flagellar 및 chemotaxis에 관련된 유전자 군의 제거...46
• 5. 아미노산 합성경로에 관련된 유전자 군의 제거...48
• 6. 협기성 호흡 대사경로에 관련된 유전자 군의 제거...51
• 제 4 절 Tn5-coupled Cre/loxP excision system과 bidirectional deletion system을 이용한 E. coli 유전체의 제거...52
• 1. Tn5-coupled Cre/loxP excision system 개발...52
• 2. Bidirectional deletion system을 통한 유전체 제거...64
• 제 5 절 Cumulative deletion을 통한 유전체의 35%(1.6Mb)가...73
• 1. 유전체 절편 교환 기술 개발 (Genome swapping)...73
• 2. P1 transduction을 이용한 유전체 축소 인공균주 구축...75
• 3. 유전체의 약 35%가 제거된 인공 균주 구축....76
• 6 절 유전체 축소 인공 E. coli의 특성 분석...77
• 1. 유전체 축소 인공대장균주의 제거되어진 유전자들의 기능과 크기...77
• 2. 유전체 축소 인공대장균주의 성장속도와 phenotype 분석...79
• 3. DNA chip 분석을 이용한 유전체 축소 인공대장균주의 유전자 발현양상...81
• 4. 2-D gel 분석을 통한 유전체 축소 인공대장균주의 단백질 발현양상...82
• 제 7 절 축소 유전체 E.coli의 대사경로 분석 및 재설계를 이용한 산업용 인공균주 구축...83
• 1. 축소 유전체 E.coli의 대사 경로 분석 및 재설계를 통한 carotenoid 대량 생산 균주 구축...83
• 3. 대사경로 분석 및 재설계를 통한 Threonine 대량생산 균주 구축...88
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...91
• 제 1 절 계획대비 달성도...92
• 제 2 절 관련분야에의 기여도...95
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...97
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...98
• 제 7 장 참고문헌...100