초록 ▼

탄저균은 치명적인 생물학적 살상무기로 사용될 수 있는 그람양성세균으로, 독소를 생산하여 인체 내 면역체계를 교란시켜 생명을 위협하는 치명적인 병원균이다. 효과적인 예방 및 치료제 개발을 위해서는 탄저독소에 의한 병인기전 및 세포면역학적 특성을 규명하는 것이 중요하다. 본 연구에서는, 실험용 마우스를 이용하여 탄저균 Bacillus anthracis의 방어항원(PA)과 치사요소(LF)로 구성된 치사독소(LT)가 체내 면역반응 교란에 미치는 영향에 대하여 연구하여, 예방 및 치료법 개발을 위한 핵심 자료를 얻는 것이 최종목표이다. 본

탄저균은 치명적인 생물학적 살상무기로 사용될 수 있는 그람양성세균으로, 독소를 생산하여 인체 내 면역체계를 교란시켜 생명을 위협하는 치명적인 병원균이다. 효과적인 예방 및 치료제 개발을 위해서는 탄저독소에 의한 병인기전 및 세포면역학적 특성을 규명하는 것이 중요하다. 본 연구에서는, 실험용 마우스를 이용하여 탄저균 Bacillus anthracis의 방어항원(PA)과 치사요소(LF)로 구성된 치사독소(LT)가 체내 면역반응 교란에 미치는 영향에 대하여 연구하여, 예방 및 치료법 개발을 위한 핵심 자료를 얻는 것이 최종목표이다. 본 연구진은 1차년도에서 치사독소 PA와 LF의 세포성 면역반응과 병인기전에 대한 기초 연구를 수행한 결과를 바탕으로, 본 연구(2차년도)에서는 치사독소의 작용기작 및 상호작용을 규명하는 심화연구를 수행하였다. 주 연구 내용은 (1) 마우스에서 PA와 LF에 의한 림프구 증식억제 기전에 대한 연구, (2) 그람양성세균 LTA에 의한 수지상세포 분화 및 활성화 시 LF와 PA에 의한 작용기전 연구이다. 대표적 연구결과로는 다음과 같다.
(1) 마우스 비장세포를 CFSE로 표지한 후 치사독소와 함께 B세포 특이 증식유도제인 PAM2CSK4, PAM3CSK4, LPS를 3일간 처리하여, B세포 특이마커 CD45R와 T세포 특이마커 CD3에 대한 형광항체를 이용하여 림프구별 증식양상을 유세포분석기로 분석하였다. 그 결과 BALB/c 마우스 B세포는 치사독소에 의해 증식이 억제됐으나, C57BL/6 마우스 B세포의 증식은 억제되지 않았다. T세포 특이 증식유도제인 ConA를 이용해 T세포 증식을 유도한 경우, BALB/c와 C57BL/6 마우스 T세포 증식이 모두 치사독소에 의해 강하게 억제되었다. BALB/c 마우스 B세포에서 PA수용체 발현은 치사독소에 의해 증가했으나, C57BL/6 마우스 B세포에서는 변화가 없었다. 반면 T세포의 PA수용체 발현이 마우스 두 종에서 모두 미약했다. Clathrin-coated pit 억제제인 Chloropromazine, lipid raft 억제제인 Filipin과 Nystatin, 그리고 cell trafficking 억제제인 Brefeldin A를 이용하여 치사독소의 증식억제기전을 분석한 결과, 림프구 특이 증식 과정은 lipid raft, clathrin-coated pit 및 세포 내 이입과정이 필요하나, 치사독소의 작용기전은 lipid raft와는 상관관계가 없음을 확인했다.
(2) Staphylococcus aureus LTA를 부탄올 추출과 octyl-sepharose column, DEAE-sepharose column 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여 정제하였다. LAL 테스트, SDS-PAGE 후 silver staining, UV spectrophotometry 등 다양한 방법으로 순도를 측정한 결과 고순도의 LTA가 정제되었음을 알 수 있었고, 대식세포 활성화 실험 등을 통해 LTA 고유의 생물학적 활성을 지님을 확인할 수 있었다. 순수분리한 LTA를 사용하여 골수유래 수지상세포의 분화 및 활성화에 대한 치사독소의 영향을 살펴본 결과, 치사독소는 그람음성세균의 LPS 뿐만 아니라 그람양성세균의 LTA에 의해 유도된 수지상세포의 성숙 및 항원탐식능 같은 활성을 억제시켰을 뿐만 아니라 염증성 싸이토카인의 발현을 억제시키는 것을 알 수 있었다.
이상의 연구를 통해, 치사독소에 의한 B 림프구의 증식억제 효과는 마우스 알로타입 차이에 따라 다르며, 이는 치사독소 수용체 발현양상과 상관관계가 있음을 규명하였다. 또한 그람양성세균인 탄저균의 경우 LPS를 발현하지 않고 LTA를 발현하므로, LTA와 치사독소와의 관계를 연구한 본 연구결과는 그람양성세균 감염에 대한 체내 면역반응을 이해하는데 귀중한 자료가 될 것이다.

Abstract ▼

Bacillus anthracis, a gram-positive bacterium that can be potentially used as a bio-weapon, produces anthrax toxins capable of perturbing the host immune system. Understanding of cellular immune responses to anthrax toxins is important for developing effective vaccines and therapeutics against B. an

Bacillus anthracis, a gram-positive bacterium that can be potentially used as a bio-weapon, produces anthrax toxins capable of perturbing the host immune system. Understanding of cellular immune responses to anthrax toxins is important for developing effective vaccines and therapeutics against B. anthracis. In the present study, we investigated the immuno-modulating activities of lethal toxin (LT), a heterodimer of protective antigen (PA) and lethal factor (LF) in experimental mice. The research focuses were (1) to investigate mechanism for the inhibitory effects of LT on the mouse lymphocyte proliferation, and (2) to characterize the effects of LT on the maturation and activation of dendritic cells (DCs) induced by lipoteichoic acid (LTA). Major findings are as follows:
(1) Mouse splenocytes were stimulated with B-cell mitogens (PAM2CSK4, PAM3CSK4, and LPS) or a T-cell mitogen (ConA) in the presence of LT, and the proliferation of B- or T-cells was examined using CFSE with lymphocyte specific markers (CD45R for B-cell and CD3 for T-cell) by flow cytometry. LT suppressed the proliferation of B-cells from BALB/c but not from C57BL/6 while LT remarkably inhibited T-cell proliferation in both mouse strains. The expression of PA receptors increased by LT on B-cells from BALB/c but not from C57BL/6. There was a positive correlation between the LT-suppressed lymphocyte proliferation and the expression of PA receptors. Experiments using inhibitors for clathrin-coated pits, lipid rafts, and intracellular trafficking demonstrated that all of theses were involved in the lympho-proliferation while the inhibitory effect of LT on the lympho-proliferation is not related with lipid rafts formation.
(2) LTA was purified from Staphylococcus aureus by n-butanol extraction, octyl-sepharose column, and DEAE-sepharose column chromatographies. Various physicochemical and biological experiments showed that LTA was highly-pure and functional. Immature DCs were prepared from mouse bone marrow cells with GM-CSF and the effect of LT on their maturation and activation induced by the LTA was examined by flow cytometry. LT inhibited the maturation and activation of DCs stimulated with LTA as with LPS. Attenuated expression of pro-inflammatory cytokines was observed under the same conditions.
Conclusively, LT inhibits DC activation and lymphocyte proliferation. Notably, the inhibitory effect of LT on B cell proliferation depends on mouse allotypes with differential expression of PA receptors in response to LT.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 최종결과보고서 ...5
• 목차 ...6
• I. 연구개발결과 요약문 ...7
• 한글 요약문 ...7
• 영문 요약문...8
• II. 학술연구용역사업 연구결과 ...9
• 제1장 최종 연구개발 목표 ...9
• 제1절 목표 ...9
• 제2절 목표달성도 ...11
• 제3절 국내.외 기술개발 현황 ...11
• 제2장 최종 연구개발 내용 및 방법 ...13
• 제1절 마우스에서 PA와 LF에 의한 림프구 증식억제기전 연구 ...13
• 제2절 그람양성세균의 lipoteichoic acid (LTA)에 의한 수지상세포 분화 및 활성화에 대한 LF, PA의 영향과 작용기전 연구 ...14
• 제3장 최종 연구개발 결과 ...16
• 제1절 마우스에서 PA (방어 항원)와 LF (치사 요소)에 의한 림프구 증식억제기전 연구 ...16
• 제2절 그람양성세균의 LTA에 의한 수지상세포 분화 및 활성화에 대한 LF, PA의 영향과 작용기전 연구 ...25
• 제4장 연구결과 고찰 및 결론 ...32
• 제5장 연구성과 ...33
• 제6장 기타 중요변동사항 ...35
• 제7장 참고문헌 ...36
• 제8장 첨부서류 ...38