초록 ▼

○ Methylotrophic bacteria는 메탄이나 메탄올과 같은 일원자 탄소화합물 (C1 화합물)을 유
일한 에너지 및 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있는 세균으로 생태계에서 탄소순환에 중요한
역할을 하고 있을 뿐만 아니라 다른 생물들이 이용할 수 없는 C1 화합물에 내재된 화학에너지
와 탄소를 이용하여 성장하는 독특한 특성을 가지고 있다. 특히 이 세균들에 존재하는 특이효
소 (monooxygenase)를 이용하면 trichloroeth- ylene이나 methyl sulfide 등의 난분해성 물질제거

○ Methylotrophic bacteria는 메탄이나 메탄올과 같은 일원자 탄소화합물 (C1 화합물)을 유
일한 에너지 및 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있는 세균으로 생태계에서 탄소순환에 중요한
역할을 하고 있을 뿐만 아니라 다른 생물들이 이용할 수 없는 C1 화합물에 내재된 화학에너지
와 탄소를 이용하여 성장하는 독특한 특성을 가지고 있다. 특히 이 세균들에 존재하는 특이효
소 (monooxygenase)를 이용하면 trichloroeth- ylene이나 methyl sulfide 등의 난분해성 물질제거는 물론 고온, 고압이 요구되거나 고비용이 소요되는 유용물질 생산을 생물전환 방법으로 쉽게 처리해 낼 수 있다.
○ 산화적 생물전환 (oxidative biotransformation)방법이 화학 전환보다 더욱 유용한 이유는
다음과 같다. 첫째, 화학적인 전환방식은 요구되는 regioselectivity 와 stero- selectivity를 충족시키기 어렵다. 둘째, 독성이 강한 화학 촉매보다 환경친화적이며 공기 중의 산소를 이용한다.
셋째, 의약품의 중간물질 및 chiral building block을 이용하여 활성을 더욱 증가시킬 수 있다.
1차년도(2002)
?일원자 탄소 대사 미생물의 유전자 library 구축
?구축된 library의 염기서열 고속해독
?Blast search 및 유전자 분석을 통한 oxygenase유전자 선별(최소 5종 이상)
?선별된 oxygenase 유전자의 open reading frame 및 promoter 클로닝(최소 5개 이상)
?Oxygenase의 conserved domain 분석 및 grouping
?각종 발현 벡터에 클로닝한 후 단백질 발현 최적화
?Oxygenase 유전자 발현 및 산물 분석
?화학합성에 의한 인디루빈 유도체 50종 개발 (위탁과제)
2차년도(2003)
?과도 발현된 oxygenase 분리 및 정제
?정제된 oxygenase를 이용한 인디고 및 인 디고 유도체 생산
?최적 조건에서의 인디고 및 인디고 유도체 대량생산 (인디고, 0.5-1.0g/L; 인디루빈, 50-100mg/L)
?형질전환된 미생물을 이용한 인디고 및 인디고 유도체 생산
?최적발효조건 산출을 통한 인디고 및 인디루빈 유도체의 대량생산 (인디고, 0.5-1.0g/L; 인디루빈, 50-100mg/L)
?물리적 방법 또는 크로마토그래피를 이용한 분리 및 정제
?화학합성에 의한 인디루빈 옥심 유도체 100종 개발 (위탁과제)
3차년도(2004)
?인디고 유도체에 의한 cyclin-dependent kinase 억제 효과 검증
?인디고 유도체에 의한 proliferation과 cell cycle에 미치는 영향 분석
?인디고 유도체가 세포주기 관련 단백질에 미치는 영향 분석
?인디고 유도체에 의한 oncoprotein의 분해 경로 규명
?인디고 유도체에 의한 apoptosis 분석
?인디루빈 유도체중 고항암 활성 유도체의 대량 화학합성 기술 개발

Abstract ▼

Indigo is a blue dye used extensively in the textile industry. The original source of it was plants but presently it is produced by chemical synthesis. However, chemical indigo has raised severe environmental problems due to its recalcitrancy.
Many groups have searched for microorganisms capable

Indigo is a blue dye used extensively in the textile industry. The original source of it was plants but presently it is produced by chemical synthesis. However, chemical indigo has raised severe environmental problems due to its recalcitrancy.
Many groups have searched for microorganisms capable of indigo producing. The enzyme system responsible for indigo production generally consists of one or more enzymes, including monooxygenases, dioxygenases and hydrolases. Several genes encoding these enzymes have been cloned into Escherichia coli strains to produce indigo directly from glucose or nutrient medium. However, the microbial production has yet to be further optimized to obtain a high enough titer of indigo to substitute for commercial chemical synthesis.

목차 Contents

• 제출문...1
• 요약문...2
• SUMMARY...4
• CONTENTS...6
• 목차...8
• 제1장 연구개발과제의 개요...10
• 가. 연구개발의 필요성...10
• (1) 기술적 측면...10
• 1) 미생물 유전체를 이용한 인디고 대량 생산 ...10
• 2) 미생물 유전체를 이용한 인디루빈 생산 ...12
• (2) 경제?산업적 측면 ...12
• 1) 천연염료로서의 인디고 생산...12
• 2) 치료제로서의 인디루빈 생산 ...13
• (3) 사회?문화적 측면...13
• 제2장 국내외 기술개발 현황...14
• 가. 외국의 경우...14
• 나. 국내의 경우...14
• 다. 조사연구개발사례에 대한 평가...14
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...15
• 제1절 fmo 유전자의 클로닝...15
• 가. 청색소 생산 클론의 분석...15
• 나. 염기서열 결정...16
• 다. 발현단백질 아미노산 서열의 분석...16
• 라. 청색소의 분자량 측정...21
• 제2절 재조합 대장균을 이용한 indigo와 indirubin 생산...22
• 가. Indigo 생산...22
• (1) 배지조성...23
• (2) pH...23
• (3) 온도...23
• (4) 숙주 대장균의 선택...23
• (5) 용존산소의 영향...24
• 나. 인디고 분리 및 정제...27
• 다. 재조합 미생물로부터 생산된 Bio-indigo를 이용한 천연염색...28
• 제3절 Flavin-containing monooxygenase (FMO) 정제 및 특성 조사...29
• 가. FMO의 정제...29
• 나. FMO 단백질의 특성...29
• (1) 분자량...29
• (2) 온도와 pH의 영향...29
• (3) 온도 안정성...30
• (4) Km, Vmax 결정...33
• (5) 기질 특이성...33
• 다. 흡수스펙트럼...33
• 라. FMO의 활성 부위...34
• 제4절 인디루빈 유도체 화학합성...36
• 가. 인디루빈 Amine 유도체 합성...36
• 나. 인디루빈 Amide 유도체 합성...37
• 다. 인디루빈 amide 유도체를 이용한 indirubin oxime 합성...38
• 라. 인디루빈 유도체들의 suzuki coupling reaction...39
• 마. 화학합성 인디루빈 유도체의 항암활성 측정...41
• (1) RK3E-Ras cells에서 인디루빈 유도체 처리 후 세포활성 측정...41
• (2) RK3E-Ras cells에서 인디루빈 유도체 처리 후 DNA fragmentation 측정...41
• (3) Apoptosis를 측정하기 위한 Annexin-V-FLUOS/Propidium iodide double staining assay...43
• (4) 암세포 진행에 대한 인디루빈 유도체의 영향...43
• (5) 인디루빈 유도체 처리 후 암세포 크기 측정...44
• (6) 인디루빈 유도체 처리 후 Softex x-ray 분석...44
• (7) 인디루빈 유도체 처리 후 암세포의 조직학적 분석...44
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...46
• 가. 타 연구에의 응용...46
• 나. 실용화...46
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...47
• 제6장 참고문헌...48