초록 ▼

[1] 멜라민의 조제물의 농도 분석법 Validation 및 안정성 확인시험
본 시험에서는 HPLC를 이용하여 멜라민 및 시아뉼산의 조제물의 농도분석법을 검증하고, 안정성을 확인하였다. 시스템적합성, 직선성, 특이성, 일내재현성 측정결과 판정기준을 모두 만족하였으며, 조제물은 상층, 중층, 하층에서 모두 균질하였다. 또한 멜라민의 조제물 0.1, 20 mg/mL의 농도 및 시아뉼산의 조제물 0.01, 200 mg/mL의 농도에서 실온 4시간 및 냉장조건하에서 7일간 안정한 것으로 확인되었으며, 측정을 위해 처리된 시료는 aut

[1] 멜라민의 조제물의 농도 분석법 Validation 및 안정성 확인시험
본 시험에서는 HPLC를 이용하여 멜라민 및 시아뉼산의 조제물의 농도분석법을 검증하고, 안정성을 확인하였다. 시스템적합성, 직선성, 특이성, 일내재현성 측정결과 판정기준을 모두 만족하였으며, 조제물은 상층, 중층, 하층에서 모두 균질하였다. 또한 멜라민의 조제물 0.1, 20 mg/mL의 농도 및 시아뉼산의 조제물 0.01, 200 mg/mL의 농도에서 실온 4시간 및 냉장조건하에서 7일간 안정한 것으로 확인되었으며, 측정을 위해 처리된 시료는 autosampler 내에서 13시간 동안 안정하였다.
[2] LC/MS/MS를 이용한 랫드 혈장 중 멜라민 및 시아뉼산의 분석법 validation 본 시험은 LC/MS/MS를 이용한랫드 혈장 중 멜라민 및 시아뉼산의 분석법을 검증하기 위해 실시되었고 시료처리는 단백질 침전법에 의해서 수행되었다. 특이성, Carry-Over, 생체시료의 영향, 회수율, 직선성, 일내 재현성, 일간 재현성은 판정기준을 만족하였으며, 랫드 혈장 중 멜라민과 시아뉼산은 3번의 냉？해동 주기, 실온에서 24 시간, 10 ${^{\circ}C}$에서 24 시간 및 -70 ${^{\circ}C}$에서 203 일 동안 안정하였다.
[3] 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 2주 반복 경구 병용투여 용량결정시험
본 시험은 멜라민 및 시아뉼산의 13주 반복투여 독성시험시 용량설정 근거로 사용하고자, 6주령 (투여개시시) 암수 F344 (F344NSlc) 랫드에 멜라민과 시아뉼산을 동일용량으로 한 3.1, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 mg/kg의 6개의 용량으로 2주간 총 12회 경구로 병용 투여하였다. 멜라민 단독투여군에 100 mg/kg의 용량으로 멜라민을, 대조군에는 1% CMC-Na 수용액을 2주간 총 12회 경구로 투여하였다.
일반증상관찰, 체중측정, 부검시 장기의 중량측정과 육안적 검사 및 조직병리학적 검사를 수행하였다.
수컷은 시험물질 50 mg/kg 투여군 이상에서, 암컷은 시험물질 12.5 mg/kg 투여군 이상에서 빈사 또는 사망동물이 관찰되었고, 빈사동물에서 불규칙호흡, 체온저하, 자발운동 소실, 입모, 코주위 오염, 진전 등의 증상이 관찰되었다. 암수 시험물질 25 mg/kg 투여군 이상에서 입모가 관찰되었다.
암수 시험물질 12.5 mg/kg 투여군 이상에서 체중감소 또는 증가억제가 용량의존적으로 관찰되었다. 장기중량에 있어서, 신장이 암수 12.5 mg/kg 투여군 이상에서 증가하였고, 흉선이 암수 25 mg/kg 투여군 이상에서 감소하였다.
부검결과, 암수 6.25 mg/kg 투여군 이상에서 신장의 반상, 모래를 써는 듯한 경도를 동반한 퇴색 또는 종대가 관찰되었다. 소형흉선이 수컷 시험물질 25 mg/kg 이상에서, 암컷 시험물질 50 mg/kg 이상에서 관찰되었다. 소형고환이 수컷 시험물질 25 mg/kg 이상에서 관찰되었다.
조직병리학적 검사 결과, 암수 6.25 mg/kg 투여군 이상에서 신장의 세뇨관의 변성, 원형 또는 과립상 결정의 침착, 세뇨관의 확장, 급성 간질성 염증 소견이 중등도 또는 현저하게 관찰되었다. 또한 흉선 피질부의 세포밀도의 감소, 비장의 적수에서 세포밀도의 감소가 경미하게 관찰되었다.
이상으로 멜라민 및 시아뉼산을 2주 경구 반복 투여한 결과, 6.25 mg/kg 투여군에서 병용투여에 기인한 신장에서의 독성변화가 인정되었다. 따라서 13주 반복투여 독성시험의 최고용량은 6.25 mg/kg 으로 설정해야 할 것으로 판단된다.
[4] 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 13주 반복 경구 병용투여 독성시험
본 시험은 멜라민과 시아뉼산의 13주 반복 병용투여 독성시험에 대한 안전성을 평가하고자, F344 (F344NSlc)계 암수 랫드에 멜라민과 시아뉼산을 동일 비율로 0.6+0.6, 1+1, 1.8+1.8, 3.3+3.3 및 6+6 mg/kg의 5개의 용량과 대조군의 6개군으로 13주간 경구 투여하였다.
관찰기간동안 일반증상관찰, 체중측정, 사료섭취량 측정, 뇨검사, 암컷의 성주기 검사를 실시하고, 관찰기간 종료 후 혈액 및 혈액생화학적 검사, 수컷의 부고환 미부내 정자검사, 장기의 중량측정, 부검시 육안적 검사 및 조직병리학적 검사를 수행하였으며, 독성동태시험을 통해 약물의 전신노출도를 확인하였다.
체중, 사료섭취량, 뇨검사, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 암컷 성주기 검사, 수컷의 정자검사 및 장기중량에서 시험물질 투여에 기인한 독성변화는 인정되지 않았다.
암컷 6+6 mg/kg 투여군의 1례에서 일반증상으로 혈뇨가 관찰되었고, 뇨검사 결과에서 호박색뇨, 혼탁뇨, 단백뇨, 잠혈이 관찰되었다. 또한 조직병리학적 검사 결과에서 신장의 세뇨관 상피 및 집합관의 변성의 형태학적 변화도 동반하였다.
부검결과, 암수 6+6 mg/kg 투여군에서 신장의 반상이 관찰되었다.
조직병리학적 검사 결과, 암수 6+6 mg/kg 투여군의 신장에서 국소성의 신장 세뇨관의 상피 변성이 관찰되었고, 암컷 1례에서만 결정 침착, 간질의 림프구성 염증이 관찰되었다. 결정의 침착 없이 세뇨관의 변성만 관찰된 례는 광학현미경으로는 검출되지 않는 미세한 결정에 의하여 세뇨관의 변성이 속발된 것으로 추정되었다. 투여시 투여개시일에 비해 수컷과 암컷 모두에서 전신노출도의 뚜렷한 증가나 감소현상을 발견할 수 없었다. 시아뉼산의 경우, 투여기간이 증가 할수록 전체적으로 전신노출도가 약간 감소되는 경향을 보였다. 투여 13주의 투여전에 멜라민이 암컷에서만 모든 농도에서 검출되었으나, 그 외 주목할 만한 성별간의 차이는 없었다.
이상으로 멜라민과 시아뉼산에 대한 암수 랫드를 이용한 13주 반복 경구 병용투여 독성시험을 실시한 결과, 본 시험 조건 하에서의 무독성량 (NOAEL)은 암수 멜라민과 시아뉼산 3.3+3.3 mg/kg으로 판단된다.
[5] 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 조성비율 차이에 따른 13주 반복 경구 병용투여 독성시험
본 시험은 멜라민과 시아뉼산의 조성비율의 차이에 따른 13주 반복 병용투여 독성시험에 대한 안전성을 평가하고자, F344 (F344NSlc)계 암수 랫드에 멜라민과 시아뉼산을 9:1, 7:3, 5:5, 3:7 및 1:9비율로 산정한 10.8+1.2, 8.4+3.6, 6+6, 3.6+8.4 및 1.2+10.8 mg/kg의 5개의 용량과 대조군의 6개군으로 13주간 경구 투여하였다.
관찰기간동안 일반증상관찰, 체중측정, 사료섭취량 측정, 뇨검사, 암컷의 성주기 검사를 실시하고, 관찰기간 종료 후 혈액 및 혈액생화학적 검사, 수컷의 부고환 미부내 정자검사, 장기의 중량측정, 부검시 육안적 검사 및 조직병리학적 검사를 수행하였으며, 독성동태시험을 통해 약물의 전신노출도를 확인하였다.
일반증상, 체중, 사료섭취량, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 암컷 성주기 검사, 수컷의 정자검사 및 장기중량에서 시험물질 투여에 기인한 독성변화는 인정되지 않았다. 뇨검사 결과, 수컷 6+6 mg/kg 투여군에서 염소의 증가가 인정되었다.
부검결과, 암수 8.4+3.6 mg/kg 투여군에서 신장의 반상이, 암컷 10.8+1.2 mg/kg 투여군에서 신장의 퇴색이 관찰되었다. 조직병리학적 검사 결과, 암수 시험물질투여군에서 신장 세뇨관에 결정 침착, 피질에 국소 확장성의 세뇨관 상피 변성, 국소성의 간질신장염, 세뇨관 확장 및 세포부스러기, 호중구 세포를 동반한 세뇨관 확장이 관찰되었고, 결정의 출현은 6+6 mg/kg 투여군에서 수컷 2례와 암컷 1례, 1.2+10.8 mg/kg 투여군에서 수컷 1례만 관찰되었다. 결정의 침착 없이 세뇨관의 변성만 관찰된 례는 광학현미경으로는 검출되지 않는 미세한 결정에 의하여 세뇨관의 변성, 확장, 간질의 염증이 속발된 것으로 추정되었다.
투여개시일 및 투여 13주에 멜라민 및 시아뉼산의 전신노출도 ($AUC_{last}$, $C_{max}$)는 조성비율 및 각각의 용량에 비례적이지는 않지만 암수 모두 증가하는 경향을 나타내었다.
투여 13주에 투여개시일에 비하여 시아뉼산의 비율이 증가할수록 멜라민은 암수 모두 전신노출도가 약간 감소하는 경향을 보였고, 시아뉼산은 암수 모두 전신노출도가 증가하는 경향을 보였다. 멜라민의 경우, 암수 성차는 인정되지 않았으며, 반복투여로 인해 약물의 배출 속도가 암컷에서 약간 지연되는 현상이 발견되었다. 시아뉼산의 경우에는 투여기간 및 용량에 따른 성별간의 차이는 발견되지 않았다.
이상으로 멜라민과 시아뉼산의 조성비율의 차이에 대한 암수 랫드를 이용한 13주 반복 경구 병용투여 독성시험을 실시한 결과, 멜라민과 시아뉼산의 조성이 5:5인 6+6 mg/kg의 용량에서 신장내 결정 및 신장의 형택학적 이상이 명확하게 인정되었으며, 그 이외의 조성에서도 신장에 대한 영향이 인정된다.

Abstract ▼

[1] Validation of analytical method and determination of the stability of Melamine and Cyanuric acid‘s formulation
This study was to validate the analytical method of a high performance liquid chromatography (HPLC) method and to determine the stability of Cyanuric acid of the dosing formulations.

[1] Validation of analytical method and determination of the stability of Melamine and Cyanuric acid‘s formulation
This study was to validate the analytical method of a high performance liquid chromatography (HPLC) method and to determine the stability of Cyanuric acid of the dosing formulations. Theresults of system suitability, linearity, specificity and intra-day variation were acceptable. All dosing formulations were homogeneous in the top, middle and bottom. In addition, 0.1, 20 mg/mL Melamine and 0.01, 20 mg/mL Cyanuric acid of the dosing formulations were stable for four hours at room temperature and seven days under refrigeration. These samples for analysis were stable for 13 hours in the autosampler.
[2] An Analytical Method Validation for the Determination of Melamine and Cyanuric acid in Rat Plasma by LC/MS/MS
This study was conducted to validate the analytical method of Melamine and Cyanuric acid in rat plasma using liquid chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). The analytical sample procedure was conducted by a protein precipitation method. The results of specificity, residual material, matrix effect, recovery, linearity, intra- and inter-day variations were acceptable. The Melamine and Cyanuric acid in rat plasma were stable on three freeze/thaw cycles, at room temperature for 24 hours, 10oC for 24 hours and -70oC for 203 days, respectively.
[3] 2-week repeated oral dose range finding study of Melamine and Cyanuric acid
This study was conducted to determine the dose levels for the 13-week repeated dose toxicity study of the test substances, Melamine (M) and Cyanuric acid (C). The test substances were administered five times per week to six week old F344 (F344NSlc) rats by oral gavage for thirteen weeks.
Six groups of the test substance, the combination M/C, at a ratio of 1:1, were designated as Groups 2, 3, 4, 5 and 6 at dose levels of 3.1, 6.25, 12.5, 50 and 100 mg/kg, M and C respectively; one Melamine group, 100 mg/kg, Group 8, plus the control, Group 1 (1% CMC solution only).
Parameters evaluated included; mortality, clinical signs, body weight, gross post mortem examinations, organ weights and histopathological evaluations of selected tissues. 1/5 female in the 12.5 mg/kg group, 2/5 females in the 25 mg/kg group, 1/5 male and 3/5 females in the 50 mg/kg group, 4/5 males and 4/5 females in the 100 mg/kg group died during the course of the study. Irregular respiration, hypothermia, loss of locomotor acitivity, piloerection, dirty nose and/or tremor were evident in moribund females in the 50 and 100 mg/kg groups. Piloerection was evident in both surviving males and females in the 12.5, 25, 50 and 100 mg/kggroups.
Decrease of body weights was evident dose-dependently in both males and females in the 12.5, 25, 50 and 100 mg/kg groups. Increased organ weights of the kidneys were evident in both males and females in the 12.5, 25, 50 and 100 mg/kg groups. Decreased organ weights of the thymus were evident in both males and females in the 25, 50 and 100 mg/kg groups.
Mottled, gritty discolored, and/or enlarged kidney were evident in both males and females in 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 mg/kg groups, macroscopically. In addition, small thymus and testes were evident of males in 25, 50 and 100 mg/kg groups and small thymus were evident of females of 50 and 100 mg/kg groups, respectively. Test substance-related hiostopathologic findings were evident in only kidneys of both males and females in the 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 mg/kg groups at the end of the dosing period.
These findings were consisted of epithelial degeneration of renal tubule, appearance of circular or granular crystal formation, acute interstitial inflammation, in the kidney.
In addition, decreased celluarity of thymic cortex and/or spleic red pulp were evident of males of 12.5, 25, 50 and 100 mg/kg groups and in females of 50 and 100 mg/kg groups. Based on the result of the 2-week dose range finding study of Melamine and Cyanuric acid, the toxicological effects of the kidneys were evident in the 6.25 mg/kg group. Therefore, the high dose level is considered to be 6.25 mg/kg for 13-week repeated dose toxicity study.
[4] 13-week repeated oral d ose Combined Toxicity study of Melamine and Cyanuric acid
This study was conducted to assess the cumulative toxicity of the test substances, Melamine (M) and Cyanuric acid (C), when administered five times per week to six week old F344 (F344NSlc) rats by oral gavage for thirteen weeks. Five groups of the test substance, the combination M/C, at a ratio of 1:1, were designated as Groups 2, 3, 4, 5 and 6 at dose levels of 0.6+0.6, 1+1, 1.8+1.8, 3.3+3.3 and 6+6 mg/kg, M+C respectively plus the control, Group 1 (1% CMC solution only). Nine additional animals were
added to each group for toxicokinetic determinations, Groups 7, 8, 9 and 10 at dose levels of 1.8+1.8, 3.3+3.3 and 6+6 mg/kg, M+C respectively plus the control.
Parameters evaluated included; mortality, body weights, food consumption, urinalysis, hematology, clinical chemistry, vaginal cytology, gross post mortem examinations, organ weights, sperm morphology and histopathological evaluations of selected tissues. All animals survived the duration of the study. No adverse, treatment-related effects were evident in body weights, food consumption, urinalysis, hematology, blood chemistry, vaginal cytology, sperm morphology and organ weights.
Hematuria was evident in one female in the 6+6 (M+C) mg/kg group. In addition, turbid urine, proteinuria and occult hematuria were evident in urinalysis. In histopathological evaluations,
crystal formation, degeneration of renal tubular epithelium, and interstitial inflammation were evident in the kidney. These changes were correlated with hematuria in urinary and histopathological evaluations
Mottled kidneys were evident in both males and females in the 6+6 (M+C) mg/kg group, macroscopically.
Mottled kidneys were evident in both males and females in the 6+6 (M+C) mg/kg group, macroscopically.
Test substance-related hiostopathologic findings were evident in only kidneys of both males and females in the 6+6 (M+C) mg/kg group at the end of the dosing period.
These findings were focal epithelial degeneration of renal tubule, crystal formation and interstitial inflammation in the kidneys. Crystal formation was evident only one female in this study, accompanying interstitial inflammation of the kidney. The epithelial degenerations of renal tubule without crystal formation were considered to be secondary changes due to extremely minute crystals which were undetectable under light microscopy.
AUClast and Cmax of Melamine and Cyanuric acid increased non-linearly with increased doses. There were no gender differences in any TK parameters evaluated in Melamine. The exposure of Cyanuric acid decreased with repeated doses. Melamine in plasma was detected in females prior to dosing at Week 13.
In conclusion, the no observed adverse effect level (NOAEL) was 3.3+3.3 mg/kg in both males and females of Melamine and Cyanuric acid (M+C) for 13-week oral toxicity in rats under the conditions of this study.
[5] 13 Weeks Repeated Dose Toxicity According to The Differences of The Combination Ratio of Melamine and Cyanuric acid
This study was conducted to assess the cumulative toxicity of the test substances, Melamine (M) and Cyanuric acid (C), when administered five times per week to six week old F344 (F344NSlc) rats by oral gavage for thirteen weeks according to the differences of the combination ratio of Melamine and Cyanuric acid.
Five groups of the test substance, the combination M/C, were designated as Groups 2, 3, 4, 5 and 6 at dose levels of 10.8+1.2, 8.4+3.6, 6+6, 3.6+8.4 and 1.2+10.8 mg/kg (ratio of the combination M:C - 9:1, 7:3, 5:5, 3:7, 1:9, respectively), M+C respectively plus the control, Group 1 (1% CMC solution only). Nine additional animals were added to each group for toxicokinetic determinations, Groups 7, 8, 9 and 10 at dose levels of 6+6, 3.6+8.4 and 1.2+10.8 mg/kg, M+C respectively plus the control.
Parameters evaluated included; mortality, body weights, food consumption, urinalysis, hematology, clinical chemistry, vaginal cytology, gross post mortem examinations, organ weights, sperm morphology and histopathological evaluations of selected tissues.
All animals survived the duration of the study. There were no effects on mortality and clinical signs.
No adverse, treatment-related effects were evident in clinical sign, body weights, food consumption, hematology, blood chemistry, vaginal cytology, sperm morphology and organ weights.
Increased chloride in urine was evident in males in the 6+6 (M+C) mg/kg group. Mottled kidneys were evident in both males and females in the 8.4+3.6 (M+C) mg/kg group, macroscopically. Also, discolorations of the kidney were evident in females in the 10.8+1.2 mg/kg (M+C) mg/kg group.
Test substance-related histopathologic findings were evident in only kidneys of both males and females in the 8.4+3.6, 6+6, and 3.6+8.6 (M+C) mg/kg groups, females in the 10.8+1.2 (M+C) mg/kg and males in the 1.2+10.8 (M+C) mg/kg group at the end of the dosing period. These findings were focal extensive epithelial degeneration of renal tubule, crystal formation, interstitial inflammation and tubular dilatation in the kidneys. Crystal formation was evident in only two males and one female in the 6+6 (M+C) mg/kg group and one male in the 1.2+10.8 (M+C) mg/kg group. The epithelial degenerations of renal tubule without crystal formation were considered to be secondary changes due to extremely minute crystals which were undetectable under light microscopy.
AUClast and Cmax of Melamine and Cyanuric acid increased non-linearly with increased doses. The exposure of Melamine decreased with repeated doses. The exposure of Cyanuric acidincreased with repeated doses. There were no gender differences in any TK parameters evaluated in Melamine and Cyanuric acid.
In conclusion, the crystal formation and morphological alterations in the kidneys were evident definitely in males and females of 6+6 (M+C) mg/kg (at a ratio of 1:1 of the combinationMelamin : Cyanuric acid) and these effects were evident in the malses and females of other ratio of the combination Melamin : Cyanuric acid under the conditions of this study.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 용역연구개발과제 최종보고서 ...2
• 제출문 ...5
• 목차 ...6
• I. 총괄연구개발과제 요약문 ...8
• 1. 국문요약문 ...8
• 2. 영문요약문 ...13
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...19
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ...19
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...19
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...20
• 1.3 총괄국내?외 기술개발 현황 ...20
• 1.4 총괄연구개발과정에서 수집한 국외과학기술정보 ...26
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ...27
• 1절. 연구내용 ...27
• 1.1 멜라민의 조제물의 농도 분석법 Validation 및 안정성 확인시험 ...27
• 1.2 LC/MS/MS를 이용한 랫드 혈장 중 멜라민 및 시아뉼산의 분석법 validation ...33
• 1.3 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 2주 반복 경구 병용투여 용량결정 시험 ...44
• 1.4 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 13주 반복 경구 병용투여 독성시험 ...50
• 1.5 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 조성비율 차이에 따른 13주 반복 경구 병용투여 독성시험 ...60
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ...70
• 1절. 멜라민의 조제물의 농도 분석법 Validation 및 안정성 확인시험 ...70
• 2절. LC/MS/MS를 이용한 랫드 혈장 중 멜라민 및 시아뉼산의 분석법 validation ...87
• 3절. 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 2주 반복 경구 병용투여 용량 결정시험 ...113
• 4절. 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 13주 반복 경구 병용투여독성시험 ...169
• 5절. 멜라민 및 시아뉼산의 랫드를 이용한 조성비율 차이에 따른 13주 반복 경구 병용투여 독성시험 ...296
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...428
• 4.1 총괄활용성과 ...428
• 4.1 총괄활용성과 ...429
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ...429
• 제6장 총괄참고문헌 ...429
• 제7장 총괄첨부서류 ...429
• III. 총괄 연구개발과제요약문...430