초록 ▼

1. 연구개발의 목표
심혈관질환 동물모델 및 세포배양시스템을 이용하여, 항생제 약물 심장부작용 database를 확보하고자 하며, 허혈성 심장질환의 생체지표를 발굴함으로써 심장부작용 검색 방안을 모색하고자 함..
2. 연구내용 및 방법
1) 심장질환 동물 및 세포 모델 확립 및 이를 이용한 항생제 약물 심장부작용 평가
- 동물모델 및 세포모델에서 항생제들에 의한 심장 손상 및 세포사멸 관찰
2) 동물모델 및 배양세포에서 허혈성/저산소성 손상에 대한 생체지표 후보군 발굴
- Microarray hybr

1. 연구개발의 목표
심혈관질환 동물모델 및 세포배양시스템을 이용하여, 항생제 약물 심장부작용 database를 확보하고자 하며, 허혈성 심장질환의 생체지표를 발굴함으로써 심장부작용 검색 방안을 모색하고자 함..
2. 연구내용 및 방법
1) 심장질환 동물 및 세포 모델 확립 및 이를 이용한 항생제 약물 심장부작용 평가
- 동물모델 및 세포모델에서 항생제들에 의한 심장 손상 및 세포사멸 관찰
2) 동물모델 및 배양세포에서 허혈성/저산소성 손상에 대한 생체지표 후보군 발굴
- Microarray hybridization 기법을 통한 다수의 후보 유전자군 발굴
- Gene fishing 기술을 이용한 novel gene 발굴
3) 배양심근세포 시스템에서 허혈성/저산소성 손상에 대한 생체지표 후보군 확인
- Realtime PCR을 이용한 유전자 후보군 발현 확인
- Immunocytochemistry 또는 western blot등을 이용한 유전자 후보군의 단백질 발현 확인
- 유전자 단백질 억제를 통한 심근세포의 손상 변화 관찰
4) 심장손상에 대한 생체지표 후보군과 항생제 심장부작용 간의 상관관계 규명
- Realtime PCR을 이용하여 항생제에 의한 생체지표 변화 관찰
- Immunocytochemistry 및 western blot을 이용하여 항생제에 의한 생체지표 변화 관찰
3. 연구개발 결과
1) Doxorubicin에 의한 심근세포 사멸은 농도, 시간 의존적으로 증가하였다.
2) 허혈/재관류 심근경색 동물모델에서 microarray 기법을 이용하여 심장질환 관련 유전자를 발굴하였다.
3) 일차배양 심근세포에서 microarray 기법을 이용하여 허혈손상 유전자를 발굴하였다.
4) 허혈/재관류 심근경색 동물모델과 허혈손상 심근배양세포에서 Arrdc3, Pfkfb3, Gadd45b, Snf1lk, Atf3, LOC 500552, Triprp-predicted, 그리고 Ddit4 총 8개의 유전자는 공통적으로 발현이 증가하였다.
5) 허혈/재관류 심근경색 동물모델과 허혈손상 심근배양세포에서 Arrdc3, Pfkfb3, Gadd45b, Atf3, Triprp-predicted, 그리고 Ddit4 총 6개의 유전자 발현 증가를 real-time PCR 기법을 이용하여 확인하였다.
6) 허혈손상 심근세포에서 Gadd45β mRNA와 단백질 발현이 증가하였다.
7) 허혈손상으로 인한 심근세포 사멸과정에서 gadd45β siRNA를 이용한 Gadd45β 단백질 발현 억제는 세포사멸을 감소시켰다.

Abstract ▼

1. The Goal of Research
The purpose of this research is to make database by evaluation of cardiac side effects of antiobiotic drugs, and to establish a detection system for cardiac side effects through discovery of biomarkers for ischemic injury in cardiac system.
2. Research Contents and Meth

1. The Goal of Research
The purpose of this research is to make database by evaluation of cardiac side effects of antiobiotic drugs, and to establish a detection system for cardiac side effects through discovery of biomarkers for ischemic injury in cardiac system.
2. Research Contents and Methods
1) Establishment of animal moldels of ischemic disease in vivo and in vitro, and evaluation of side effects of antibiotic drugs on heart
2) Discovery of biomarkers in animal models and cell culture systems of ischemic injury
- Discovery of multiple candidate genes by microarray
- Discovery of novel genes by gene fishing
3) Confirmation of biomarker candidates for hypoxic injury in cultured cardiac cell system
- Confirmation of gene expression by realtime PCR
- Confirmation of protein expression by immunocytochemistry and western blot
- Investigation of cell viability change after inhibition of gene and/or protein expression
4) Investigation of the correlation between cardiac side effects of antibiotic drugs and biomarker candidates for ischemic injury
- Investigation of the effects of antibiotic drugs on biomarker candidates through realtime PCR
- Investigation of the effects antibiotic drugs on biomarker candidates through immunocytochemistry and western blot
3. Research Results
1) Antibiotic drugs induced cell death in a does-dependent manner in cardiac cells.
2) Ischemia-inducible genes were discovered in myocardial infarct model using microarray
3) Hypoxia-inducible genes were discovered in cardiac cells using microarray.
4) Eight genes-Arrdc3, Pfkfb3, Gadd45b, Snf1k, Atf3, LOC 500552, Triprp-predicted, and Dditwere increased in both myocardial infarct model and hypoxic injury model of cardiac cells.
5) Increased exression of six genes-Arrdc3, Pfkfb3, Gadd45b, Atf3, Triprp-predicted, and Ddit4- were confirmed using the real-time PCR.
6) Gadd45β mRNA and protein expression was increased by hypoxic injury in cardiomyocytes.
7) Hypoxia-induced cell death was inhibited by transfection with gadd45β specific siRNA.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
• 표지 ...2
• 제출문 ...4
• 목차 ...5
• 그림목차 ...8
• 표목차 ...9
• I. 연구개발보고서 요약문 ...10
• 국문요약문 ...10
• 영문요약문 ...11
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...12
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...12
• 1. 총괄연구개발과제의 목표 ...12
• 가. 연구의 필요성 ...12
• 1) 경제적 측면 ...12
• 2) 사회적 측면 ...13
• 3) 기술적 측면 ...14
• 나. 연구의 목적 ...15
• 2. 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...16
• 3. 국내?외 기술개발 현황 ...17
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...19
• 1. 연구내용 ...19
• 가. 심혈관질환 동물 및 세포 모델 확립 및 이를 이용한 항생제 약물 심장부작용 평가 ...19
• 나. 동물모델 및 배양세포에서 허혈성/저산소성 손상에 대한 생체지표 후보군 발굴 ...19
• 다. 배양심근세포 시스템에서 허혈성/저산소성 손상에 대한 생체지표 후보군 발굴 ...19
• 라. 심장손상에 대한 생체지표 후보군과 항생제 심장부작용 간의 상관관계 규명 ...19
• 2. 연구방법 ...19
• 가. 실험동물모델에서 심근허혈 유발 ...19
• 나. 세포배양 및 저산소성 세포사멸 유도 ...19
• 다. 유전자 발굴과 유사염기서열 검색 ...20
• 라. Microarray hybridization ...20
• 마. Western blot ...20
• 바. LDH (lactate dehydrogenase) 유리 측정 ...20
• 사. MTT assay ...20
• 아. In situ terminal deoxynucleotidyl transferase UTP nick end labeling (TUNEL) assay ...20
• 자. RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) ...21
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...22
• 1. 심혈관질환 동물모델을 이용한 약물계열별 심장부작용 평가 ...22
• 가. Lomefloxacin 처리에 의한 심장부작용 평가 ...22
• 1) 심근경색 동물모델에서 Lomefloxacin 처리에 의한 infarct zone 변화 관찰 ...22
• 2) 심근배양세포에서 Lomefloxacin 처리에 의한 세포사멸 관찰 ...23
• 나. Doxorubicin 처리에 의한 심장부작용 평가 ...24
• 1) 심근경색 동물모델에서 Doxorubicin 처리에 의한 infarct zone 변화 관찰 ...24
• 2) 심근배양세포에서 Doxorubicin 처리에 의한 세포사멸 관찰 ...24
• 다. Azithromycin 처리에 의한 심장부작용 평가 ...25
• 1) 심근배양세포에서 Azithromycin 처리에 의한 세포사멸 관찰 ...25
• 2. 심혈관질환 동물모델을 이용한 생체지표 발굴 ...26
• 가. 심혈관질환 동물모델 확립 및 허혈손상 심근배양세포 시스템 조건 확립 ...26
• 1) 심혈관질환 동물모델 확립 ...26
• 2) 허혈손상 심근배양세포 시스템 조건 확립 ...26
• 나. Gene fishing 기법을 통한 후보 유전자 발굴 ...27
• 1) 허혈/재관류 심근경색 동물모델에서 심장질환 관련 유전자 발굴 ...27
• 2) 일차 배양 심근세포에서 허혈손상 유전자 발굴 ...27
• 다. Microarray 기법을 통한 후보 유전자 발굴 ...28
• 1) 허혈/재관류 심근경색 동물모델에서 심장질환 관련 유전자 발굴 ...28
• 2) 일차 배양 심근세포에서 허혈손상 유전자 발굴 ...32
• 3) 허혈/재관류 심근경색 동물모델과 허혈손상 심근배양세포에서 공통적으로 유의한 수준의 발현 변이 나타내는 유전자들 ...36
• 3. 허혈손상 심근배양세포 시스템을 이용하여 허혈손상의 생체지표 발굴 ...37
• 가. 허혈손상 심근배양세포 시스템을 이용하여 허혈손상의 생체지표 발굴 ...37
• 1) 허혈/재관류 심근경색 동물모델과 허혈손상 심근배양세포에서 공통적으로 유의한 수준의 발현 변이 나타내는 유전자를 real-time PCR로 유전자 발현 변화 확인 ...37
• 나. 허혈손상 심근세포에서 Gadd 45β의 역할 ...39
• 1) 허혈손상 심근세포에서 Gadd 45β의 mRNA 발현 변화 ...39
• 2) 허혈손상 심근세포에서 Gadd 45β의 단백질 발현 변화 ...39
• 3) Cyclophilin B siRNA를 이용한 siRNA 기법 조건 확립 ...40
• 4) Gadd 45β siRNA를 이용한 Gadd 45β의 mRNA 발현 억제 ...41
• 5) 허혈손상 심근세포사멸과정에서 Gadd 45β의 역할 ...42
• 4. 심장부작용을 검색할 수 있는 생체지표와 약물계열별 심장부작용 간의 상관관계 규명 ...44
• 가. Doxorubicin에 의한 Gadd 45β 변화 관찰 ...44
• 1) Doxorubicin에 의한 Gadd 45β mRNA 변화 관찰 ...44
• 2) Doxorubicin에 의한 Gadd 45β 단백질 발현 관찰 ...44
• 5. Doxorubicin 처리에 의한 심장부작용 관련 유전자 발굴 ...45
• 가. Doxorubicin 처리에 의한 심장부작용 관련 유전자 발굴 ...45
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...48
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...51
• 1. 활용성과 ...51
• 가. 연구논문...51
• 나. 학술발표 ...51
• 다. 지적재산권 ...51
• 라. 정책활용 ...51
• 마. 타연구/차기연구에 활용 ...51
• 바. 언론홍보 및 대국민교육 ...51
• 사. 기타 ...51
• 2. 활용계획 ...52
• 가. 추가연구의 필요성 ...52
• 나. 활용계획 ...52
• 제6장 기타 중요변경사항 ...53
• 제7장 참고문헌 ...54
• 제8장 첨부서류 ...55