초록 ▼

본 연구는 총 3년에 걸쳐 박테리아 DNA백신의 면역원성을 개선 및 그에 대한 검증기술 개발을 연구의 최종 목표로 하고 있으며, 세부적으로 1차년도는 박테리아 DNA의 Humanization (인간화) 및 평가, 2차년도는 박테리아 DNA와 사이토카인 유전자 adjuvant의 병용투여에 의한 효과와 평가 방법, 그리고 3차년도(당해년도)는 감염 모델을 이용한 DNA백신의 효과 검증을 목표로 하고 있다.
1차년도 연구에서 codon usage 인간화에 의해 제작된 hAg85B DNA 백신이 기존의 Ag85B DNA 백신과 비교하

본 연구는 총 3년에 걸쳐 박테리아 DNA백신의 면역원성을 개선 및 그에 대한 검증기술 개발을 연구의 최종 목표로 하고 있으며, 세부적으로 1차년도는 박테리아 DNA의 Humanization (인간화) 및 평가, 2차년도는 박테리아 DNA와 사이토카인 유전자 adjuvant의 병용투여에 의한 효과와 평가 방법, 그리고 3차년도(당해년도)는 감염 모델을 이용한 DNA백신의 효과 검증을 목표로 하고 있다.
1차년도 연구에서 codon usage 인간화에 의해 제작된 hAg85B DNA 백신이 기존의 Ag85B DNA 백신과 비교하여 발현 및 면역원성이 증가하였음을 확인하였으며, 2차년도 연구를 통하여 cytokine gene adjuvant 병용 투여 및 co-expression이 DNA 백신에 의한 면역 반응에 미치는 영향을 항원 특이적인 항체 생성, T cell proliferation, IFN-gamma ELISPOT assay 및 CTL assay를 이용하여 평가하였다. 당해연도 (3차년도) 연구에서는 기존의 C57BL/6 마우스 감염 모델을 기초로 BALB/c 마우스에 대한 결핵균 감염 모델을 정립하고 박테리아 DNA 백신의 효과를 평가하였으며, 결과적으로 Ag85B DNA 백신의 경우 lung에 있어서 결핵균에 대한 감염 예방효과가 약한 반면에, codon usage가 인간화된 phAg85B로 면역화한 마우스의 경우, spleen과 lung 모두에서 BCG와 유사한 정도의 감염예방효과를 관찰할 수 있었다. 기존의 연구를 바탕으로 DNA 백신의 면역성을 증가시키기 위한 genetic adjuvant로 GM-CSF와 IL-18을 cytokine adjuvant 후보로 선정하고 박테리아 DNA 백신과 병용 투여 혹은 co-expression 되도록 면역화한 후에 CD4+ T세포 혹은 CD8+ T세포에 의한 항원 특이적인 IFN-gamma 생성을 확인하고, 결핵 감염 후 PPD 혹은 CFP (culture filtrate protein)에 대한 IFN-gamma+ CD4+ T cells이 증가함을 관찰하였다. Cytokine adjuvant을 사용한 경우, 그 발현이 항원과 동일한 vector에서 발현되어 한 세포 내에서 co-expression이 되는 지 여부가 면역반응의 증가 및 IFN-gamma 발현에 영향을 미치는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 GM-CSF의 경우, single vector system의 경우 항원 특이적인 IFN-gamma 발현이 증가하였고, two vector system으로 항원과 GM-CSF를 각각 발현되도록 한 경우에는 proliferation은 증가하였으나 IFN-gamma 발현은 증가하지 않았다. 반면에 IL-18 유전자 adjuvant의 경우 two vector system의 경우에만 CD8+ epitope peptide 특이적인 IFN-gamma 생성이 증가하였다.
결론적으로 본 3차년도 연구를 통해 1차년도와 2차년도 연구를 통해 확인된 codon usage 최적화에의한 항원생산 증가 및 cytokine adjuvant의 병행 투여에 의한 박테리아 DNA백신의 면역원성 증가가 실제로 결핵균 감염 마우스 모델에서 예방효과를 보이는지 여부를 확인하였으며 결핵균 감염 마우스 모델을 통한 박테리아 DNA 백신의 평가를 위한 방법론을 정립하여 박테리아 DNA 백신의 평가를 위한 시험항목, 시험방법 및 평가기준을 확립하는데 기여하리라 예상된다.

Abstract ▼

In this study, we investigated whether optimizing the codon usage of the Ag85B DNA vaccine or coimmunization with cytokine gene adjuvant would enhance its protective efficacy against airborne M. tuberculosis H37Rv infection in the BALB/c mouse model.
At first, Mice were immunized intramuscularly

In this study, we investigated whether optimizing the codon usage of the Ag85B DNA vaccine or coimmunization with cytokine gene adjuvant would enhance its protective efficacy against airborne M. tuberculosis H37Rv infection in the BALB/c mouse model.
At first, Mice were immunized intramuscularly three times at 3-week intervals with 100μg of pAg85B, phAg85B, or mock vector. Four weeks after the final immunization, mice were exposed to 500 CFU of M. tuberculosis H37Rv via aerosol for 60 min, and bacterial numbers in organs were determined 4 weeks after infection. DNA immunization with phAg85B provided a significant level of protection against M. tuberculosis, compared with mock immunization, in both lungs and spleens, where protections were comparable to that afforded by BCG. Immunization with phAg85B achieved a more consistent and significant level of protection against M. tuberculosis infection in the lungs than did pAg85B immunization. These results demonstrate that codon-optimized pAg85B induced a higher degree of protective immunity in a BALB/c mouse model of M. tuberculosis aerosol infection than did wild-type Ag85B. In particular, the enhanced protection in the primary infection site, the lungs, is meaningful.
On the basis of previous results, we choosed the IL-18 and GM-CSF as cytokine gene adjuvant for DNA vaccine. We prepared bicistronic vectors containing both of Ag85B gene and cytokine gene (GM-CSF or IL-18) using IRES sequence. When mice were co-immunized or co-expressed with Ag85B and cytokine, GM-CSF containing bicistronic vectors increased IFN-gamma secretion by T cells, but phAg85B+pGM-CSF did not. The co-immunization of humanized bacterial DNA with IL-18 significantly augmented IFN-gamma secretion compared with those by phAg85B-IL18 bicistronic vector. The efficacy of cytokine co-expression and co-immunization was under evaluating in the M. tuberculosis infection model.
The evaluation method of DNA vaccine used in this study, such as quality evaluation of DNA plasmid, assays and their specifications, can be used as the references for the evaluation of DNA vaccine product candidates. Further, the M. tuberculosis protection model used in this study will provide standard protocol of evaluation of DNA vaccine in BALB/c mice.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
• 제출문 ...4
• 목차 ...5
• I. 연구결과보고서 요약문 ...6
• 한글 요약문 ...6
• 영문 요약문 ...7
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...8
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...9
• 1.3 국내.외 기술개발 현황 ...10
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...12
• 2.1 연구내용 ...12
• 2.2 연구방법 ...13
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...16
• 3.1 1, 2차년도 연구개발 결과 요약 ...16
• 3.2 3차년도 (최종연도) 연구개발 결과 ...24
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...28
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...30
• 5.1 활용성과 ...30
• 5.2 활용계획 ...31
• 제6장 기타 중요변경사항 ...32
• 제7장 참고문헌 ...32
• 제8장 첨부서류 ...34
• 총괄 연구과제 요약...35