초록 ▼

본 연구에서는 박테리아 DNA 백신의 발현을 증가시키기 위해 포유동물에서 사용 빈도가 낮은 codon을 사용 빈도가 높은 codon으로 변경한 후에 DNA 백신의 발현과 면역원성 증가 여부를 측정하였다. 목표항원으로는 Mycobacterium tuberculosis Ag85B를 사용하였으며, codon usage optimization에 의한 포유동물 세포에서의 protein 발현 양 증가 여부를 in vitro에서 western과 luciferase assay를 통하여 확인하였다.
DNA 백신에 사용할 DNA 백신의 품질을

본 연구에서는 박테리아 DNA 백신의 발현을 증가시키기 위해 포유동물에서 사용 빈도가 낮은 codon을 사용 빈도가 높은 codon으로 변경한 후에 DNA 백신의 발현과 면역원성 증가 여부를 측정하였다. 목표항원으로는 Mycobacterium tuberculosis Ag85B를 사용하였으며, codon usage optimization에 의한 포유동물 세포에서의 protein 발현 양 증가 여부를 in vitro에서 western과 luciferase assay를 통하여 확인하였다.
DNA 백신에 사용할 DNA 백신의 품질을 평가하기 위하여 DNA 농도와 순도를 UV spectrometer와 전기영동을 실시하여 검증하였으며, LAL assay를 통하여 endotoxin의 수준을 검증하였다.
DNA백신의 면역원성을 평가하기 위해 Ag85B와 codon usage가 최적화된 hAg85B를 발현하는 벡터 100ug를 100ul의 PBS에 희석하며, 각각 마우스 대퇴부 사두근(quadriceps)에 근육 주사한 뒤에 2주 후 boosting 하였다. 또 2주가 지난 후 serum을 얻고 lymph node와 spleen을 적출하였다. Vaccination된 마우스 serum 중의 항원 특이적인 항체는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbant assay)를 사용하여 측정하였으며, splenocyte의 항원 특이적인 proliferation 및 IFN-gamma secretion을 비교하였다. DNA vaccination 후 codon usage optimization이 Cytotoxic T lymphocyte (CTL)에 미치는 영향은 Cr release assay를 통하여 확인하였다.
이상의 실험을 통하여 codon usage optimization에 의해서 항원 특이적인 humoral immune response와 cellular immune response가 현저히 증가함을 확인하였다. 또한 이러한 면역반응 증가가 단순치 CpG motif의 증가에 의한 것이 아님을 control vector의 co-delivery 후 CD4+ T cell의 proliferation을 통하여 확인하였다.

Abstract ▼

This study was examined the protein expression level and immunogenecity of bacterial DNA vaccine after changing its codons to the codons that are utilized highly in human using the gene of Ag85B from Mycobacterium tuberculosis H37Rv as a model antigen. The protein expression level was assessed by in

This study was examined the protein expression level and immunogenecity of bacterial DNA vaccine after changing its codons to the codons that are utilized highly in human using the gene of Ag85B from Mycobacterium tuberculosis H37Rv as a model antigen. The protein expression level was assessed by in vitro western blotting and luciferase assay. The concentration and the purity of humanized DNA vaccine was examined by UV spectophotometer and agarose gel electrophoresis, and the endotoxin contamination was assessed by LAL assay. 100㎍ of the humanized DNA gene in 100μL of PBS was intramuscularly injected into quatriceps of Balb/c mouse. In a separate group, the bacterial DNA gene was injected as a control. The both genes were boosted 2 weeks after priming, respectively. The spleen and lymph node were separated and the blood was obtained another 2 weeks after boosting. The Ag85B-specific antibody titers are determined by ELISA and the Ag85B-specific proliferation and IFN-gamma secretion assay was examined.
The cytolytic activity was performed by $^{51}Cr$ release assay. The results demonstrated that the Ag85B-specific humoral immune response and cellular immune response were increased remarkably. In addition, it was indicated that this increase of immune response was not just by the increase of CpG motif when the proliferation of $CD4^+$ T cells was assessed after co-delivering with control vector to compensate the effect of increased CpG motif in the humanized Ag85B gene.

목차 Contents

• 용역연구개발사업최종보고서...1
• 제출문...2
• 연구사업 최종보고서 요약문...3
• Project Summary...4
• 목차...5
• 제1장 서론...6
• 제2장 국내ㆍ외 기술개발 현황...7
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...8
• (1) 박테리아 항원 유전자의 인간화...8
• (2) DNA 백신의 품질평가 기술 수립 및 그에 관한 검증연구...10
• (3) 인간화된 유전자를 포함하는 DNA 백신의 평가...11
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...17
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획...18
• 가. 계량적 성과...18
• 나. 성과내용기술...18
• 다. 활용계획...18
• 제6장 기타 주요변경사항...18
• 제7장 참고문헌...18
• 총괄 연구과제 요약...20