초록 ▼

간 조직에서 독성물질의 대사가 이루어질 뿐 아니라 염증반응, 발암, 호르몬대사에 영향 등의 중요성으로 간독성에 대한 동물 모델 시스템에서 이를 반영하는 유전자 생체지표(biomarker) 발굴하기 위하여, 간독성 표준화합물로서 사염화탄소(CCL4)를 생쥐에 폭로하여 간독성 장애를 일으켜 oligonucleotide-microarray와 bioinformatics 방법을 이용하여 biomarker를 발굴하고 간독성 평가용 Toxchip을 개발하기 위한 기초 자료를 제공할 뿐 아니라, 의약품의 부작용 중 사회적으로 심각한 문제가 되고

간 조직에서 독성물질의 대사가 이루어질 뿐 아니라 염증반응, 발암, 호르몬대사에 영향 등의 중요성으로 간독성에 대한 동물 모델 시스템에서 이를 반영하는 유전자 생체지표(biomarker) 발굴하기 위하여, 간독성 표준화합물로서 사염화탄소(CCL4)를 생쥐에 폭로하여 간독성 장애를 일으켜 oligonucleotide-microarray와 bioinformatics 방법을 이용하여 biomarker를 발굴하고 간독성 평가용 Toxchip을 개발하기 위한 기초 자료를 제공할 뿐 아니라, 의약품의 부작용 중 사회적으로 심각한 문제가 되고 있는 간독성 문제를 신속히 해결하는 기반을 마련하고, 신약개발을 효율적으로 진행할 수 있게 하는 표준 시험법을 제공하고자본 실험을 수행하게 되었다.
C57BL/6 수컷을 대상으로 허용치로부터 급성 간독성을 일으키는 농도(1.0 g/kg을 고용량으로 사용하고 0.3 및 0.1 g/kg) 사염화탄소($CCL_4$)를 생쥐에 처리한 후, CCL4 투여 후 2, 4, 8, 24시간째 희생한다. 그 결과 혈청내 지표 효소치는 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP) 등 2, 4, 8 시간 후에는 모든 용량에서 수치의 변화가 없다가 24시간 후에 투여량에 비례하여 효소 수치가 급격히 증가하였다. 조직손상여부는 hematoxyline/eosine 염색, PAS 염색, reticulin 염색 등으로 조사하였는데, 그 결과 0.1g/kg을 투여한 군은 소엽 3대 및 2대의 간세포의 손상과 3대 간세포의 손상 후 괴사를 유발했다. 0.3g/kg은 투여한 군은 초기 (2, 4, 8시간 후)에는 0.1g/kg은 투여한 군과 비슷해 보였으나24시간 후에는 간소엽 전체의 손상이 유발되었슴을 알 수 있었고 소엽 3대 및 2대의 간세포 괴사를 유발했다. 1g/kg를 투여한 군은 간소엽 전체의 손상과 함께 소엽 2대의 괴사가 발생했다. 간조직으로부터 고순도의 RNA를 추출하여 Genechip expression 3-amplification One-cycle cDNA 합성법으로 cDNA를 제조하였고, Affimatrix GeneChip Mouse Genome 430A 2.0 microarray에 hybridization을 시행하였다. 세척 및 스캔과정과 algorithm을 적용하여 생성된 chp.file에 대해 data QC를 수행하여 각 microarray에 대해 표준화하였다. 각 그룹의 특이한 유전자 발현의 변동을 관찰하기 위하여는 전체 유전자들에 대해 hierarchial clustering을 통하여 분석하였다.
이로서 사염화탄소($CCL_4$)의 노출에 대한 특이적인 유전자 군 및 성장시기에 따른 $CCL_4$에 노출을 반영할 수 있는 간독성 표지 유전자를 발굴하여 기존의 효소학적 방법보다 예민하며, 생물학적 장애를 반영할 수 있으며, 간 독성장애를 평가할 수 있는 Toxogenomic chip의 개발하고자 분석중에 있으며, 간독성으로 인한 섬유화의 진행, 지방변성 등을 유도하는 복잡하고 정교한 pathway 규명 등 분자생물학적 기전이 규명될 것을 기대하고 있다.

Abstract ▼

Carbon tetrachloride (CCl4) is a known environmental biohazard, which induces lipid peroxidation and oxidative damage in rat liver. CCl4-induced hepatotoxicity continues to provide an important model substance to elucidate the mechanisms of action of hepatotoxic effects such as fatty degeneration, f

Carbon tetrachloride (CCl4) is a known environmental biohazard, which induces lipid peroxidation and oxidative damage in rat liver. CCl4-induced hepatotoxicity continues to provide an important model substance to elucidate the mechanisms of action of hepatotoxic effects such as fatty degeneration, fibrosis, hepatocellular death, and carcinogenicity. To understand the molecular responses to acute CCl4 toxicity and the genetic basis of hepatic toxicity, comprehensive gene expression analysis by using oligonucleotide microarraywere were carried out.
Single dose of CCl4 aqueous suspension was given orally at three dose levels (0.1, 0.3, 1.0 gm/kg in olive oil) to the postnatal 10-weeks C57BL/6 mice, and those were sacrified at 2, 4, 8, and 24 hours after CCl4 treatements. Animals treated with CCL4 showed remarkable centrilobular fatty changes and moderate inflammatory infiltrate in the form of neutrophil and mononuclear cells when compared to the controls. Serum levels of aspartic transaminase (AST), L-alanine aminotransferase (ALT), and alkaline phosphatase(ALP) were markedly increased at 24 hrs after CCl4 administration, and the their activities were disclosed with dose-dependent manner. The total RNA was extracted from the left lobe of the liver, and analysis of the global gene expression was carried out using Affimetrix GeneChip Mouse Genome 430A 2.0 oligonucleotide microarray. The scale normalization was performed. To identify the gene representing the each groups, the data were analyzed using two-way ANOVA. The various clustering methods including hierarchial clustering and MITree clusstering were applied to find out significant genes that could explain the mechanisms of acute hepatotoxicity.
The results from this study could be applied to the field of preventive toxicology and to the development of Toxochips to facilitate the evaluation of new drug compound in pharmaceutical fields.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 용역연구개발사업 연구결과보고서 ... 3
• 제출문 ... 4
• 연구결과보고서 요약문 ... 5
• Project Summary ... 6
• 목차 ... 7
• 제1장 서론 ... 8
• 1. 연구의 목적 ... 8
• 2. 연구의 필요성 ... 8
• 제2장 국내.외 기술개발 현황 ... 10
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 11
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 22
• 가. 연구개발 목표 달성도 ... 22
• 나. 대외기여도 ... 22
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ... 23
• 가. 계량적 성과 ... 23
• 나. 성과내용기술 ... 23
• 다. 활용계획 ... 23
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 24
• 제7장 참고문헌 ... 25
• 총괄 연구과제 요약 ... 27