초록 ▼

본 연구에서는 확립된 Tris elution buffer-PEG-TRIzol-poly(dT) 추출방법 (TPTT)은 RT-PCR과 nested PCR을 수행하여 검출하고자 하는 바이러스의 검출민감성을 증진하는 결과를 보였다. 본 TPTT 방법에서 Tris-NaCl buffer (pH 9.5)를 이용하여 중장성을 균질화하고 균질화된 시료로부터 HAV를 효율적으로 추출한 후, PEG을 이용하여 바이러스를 침전 시킨 후, TRIzol reagent과 chloroform을 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 HAV RNA를 수용층에서 분

본 연구에서는 확립된 Tris elution buffer-PEG-TRIzol-poly(dT) 추출방법 (TPTT)은 RT-PCR과 nested PCR을 수행하여 검출하고자 하는 바이러스의 검출민감성을 증진하는 결과를 보였다. 본 TPTT 방법에서 Tris-NaCl buffer (pH 9.5)를 이용하여 중장성을 균질화하고 균질화된 시료로부터 HAV를 효율적으로 추출한 후, PEG을 이용하여 바이러스를 침전 시킨 후, TRIzol reagent과 chloroform을 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 HAV RNA를 수용층에서 분리하고 isopropyl alcohol를 이용하여 침전한 후 RNase-free H2O를 이용하여 현탁한 후 Poly (dT) magnetic beads를 사용하여 RT-PCR inhibitors를 제거하는 동시에 RNA를 농축, 분리하는 방법을 사용하였다. TPTT 추출법을 이용시 총 8시간이 필요하였다. 본 연구에서는 glycine과 Tris elution buffer를 사용하여 추출효율을 비교하였다. 바이러스가 감염된 시료에서 Tris elution buffer는 glycine elution buffer 보다 10배 높은 RT-PCR 검출능을 보였다. Tris elution buffer와 PEG 처리는 nested PCR에서 검출율을 향상시켰다. Nested PCR을 실시할 때 zirconium hydroxide 사용 시 보다 는 PEG을 두 번 처리하는 경우가 10,000배 민감성이 높은 결과를 보였다. 결론적으로, TPTT 방법은 신속하고 가장 효율적인 검출법을 제공하였다. 본 연구에서는 0.05g 굴조직체의 1ml에서 추출한 20%의 total RNA를 사용시 HAV 검출한계는 0.0069 PFU이었다. 같은 magnetic beads를 사용한 Kingsley와 Richards (2001)의 HAV 방법에서는 검출한계 (0.015 PFU/3.759의 굴조직)와 Cormeans 등 (1997)은 검출한계(8 PFU/lg 조직) 보다 높은 민감도를 보였으며, 노로바이러스는 식육가공품에서 $10^{-4}$ 까지 검출능을 보였다.

Abstract ▼

In this study, Tris elution buffer-PEG-TRIzol-poly(dT) extraction procedure (TPTT) was developed for a rapid and efficient detection of Norovirus and hepatitis A virus (HAV). This protocol involves homogenization of samples in Tris-NaCl buffer at pH 9.5, to elute the virus from the solids. After pr

In this study, Tris elution buffer-PEG-TRIzol-poly(dT) extraction procedure (TPTT) was developed for a rapid and efficient detection of Norovirus and hepatitis A virus (HAV). This protocol involves homogenization of samples in Tris-NaCl buffer at pH 9.5, to elute the virus from the solids. After precipitating the virus by polyethylene glycol, TRIzol reagent and chloroform were used to extract the RNA. Using viral poly (A) RNA purified by magnetic poly (dT) beads, the virus was amplified by reverse transcription-PCR and nested PCR. This method could be performed in less than 8 h. The viral extraction and concentration method that used using a Tris elution buffer and polyethylene glycol gave a 10-fold higher sensitivity than the method using a glycine elution buffer and zirconium hydroxide. The detection limit of HAV in this study was 0.0069 PFU, which suggesting that it is a method that is both quick and efficient in terms of its potential use in the detection of HAV from shellfish. The Norovirus detection level was $10^{-3}$ dilution level and successfully detected in artificially contaminated samples.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 용역연구사업 연구결과보고서 ...2
• 제출문 ...3
• 목차 ...4
• I. 연구개발결과 요약문 ...5
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 제 1 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 제 2 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...17
• 제 3 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...26
• 제 4 장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...37
• 제 5 장 총괄연구개발과제의 연구성과...39
• 제 6 장 참고문헌...41
• 제 7 장 첨부서류...43
• III. 제 1 세부연구개발과제 연구결과...46
• 제 1 장 1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...47
• 제 2 장 1세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...52
• 제 3 장 1세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...56
• 제 4 장 1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...61
• 제 5 장 1세부연구개발과제의 연구성과...62
• 제 6 장 참고문헌...64
• 제 7 장 첨부서류...65
• IV. 제 2 세부연구개발과제 연구결과...67
• 제 1 장 2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...68
• 제 2 장 2세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...72
• 제 3 장 2세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...77
• 제 4 장 2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...84
• 제 5 장 2세부연구개발과제의 연구성과...85
• 제 6 장 참고문헌...87
• 제 7 장 첨부서류...89
• V. 연구개발과제 최종 시험법...98
• 제 1 장 1세부연구개발과제의 최종 시험법...98
• 제 2 장 2세부연구개발과제의 최종 시험법...101