초록 ▼

ICH(International Committee on Harmonization)의 Guideline(Q5B: Genetic stability)에 근거하여 유전자 재조합 의약품을 발현하는 CHO cell 및 미생물 균주에서의 세포주 검증 및 유전적 안정성의 시험 항목의 적용 사례와 그 시험의 SOP를 제공하고자 하였다.
재조합 단백질의 생산에 있어서 세포주 및 미생물 균주의 안전성(각종 미생물이나 바이러스에 대해서 오염되어 있지 않음)에 대한 검증 및 유전자 재조합 생산용 세포의 제조에 있어서 세포의 기질평가 및 안정성, DN

ICH(International Committee on Harmonization)의 Guideline(Q5B: Genetic stability)에 근거하여 유전자 재조합 의약품을 발현하는 CHO cell 및 미생물 균주에서의 세포주 검증 및 유전적 안정성의 시험 항목의 적용 사례와 그 시험의 SOP를 제공하고자 하였다.
재조합 단백질의 생산에 있어서 세포주 및 미생물 균주의 안전성(각종 미생물이나 바이러스에 대해서 오염되어 있지 않음)에 대한 검증 및 유전자 재조합 생산용 세포의 제조에 있어서 세포의 기질평가 및 안정성, DNA level 및 RNA, protein level에서의 유전자 안정성의 검토는 올바른 생산품의 생산과 함께 생산성에 아주 중요한 인자이며, 유전자 재조합 의약품을 생산하는 세포주는 그 제조과정과 제조 후 관리에서 체계적인 관리가 필요하다. 따라서 이 과제에서는 유전자 재조합 의약품의 생산용 세포주의 체계적인 유전자 안정성 모델을 제시하고자 한다.
제1세부과제에서는 CHO세포주를 모델로 세포주에 대한 기본적인 검증 방법에 대하여 실험을 실시하였으며, 제 2 세부과제에서는 H.polymorpha를 이용하여 기본적인 검증방법 및 실험을 실시하였다. 각 단계마다 연구소에서 실제 수행하고 있는 SOP를 참조로 하여 기초 실험을 실시하고 그에 대하여 완전히 검증되지 않은 단계라고 하더라도 가능한 경우에는 SOP에 대한 내용은 거의 수록하고자 하였다. 비록 실험 기간이 길지 않아서 세포주의 검증에 필요한 많은 실험을 완전하게 수행하기에는 부족하였으나, 세포기질의 유전적 안정성의 확보는 의약품 생산에서 생명공학 의약품의 품질 및 안정성, 그리고 생산성에 근본적인 영향을 미친다. 이 과제를 통해서 국제적 기준에 맞는 시험법을 생명공학의약품 개발기관에 제공함으로서 보다 효율적인 제품개발에 도움이 되기를 바란다.

Abstract ▼

It has been tried to provide the applied examples and standard operating procedures of celluar safety test and genetic stability tests for the CHO cell and H.polymorpha which expresses recombinant-DNA derived pharmaceuticals based on ICH (International Committee of Harmonization) Guideline Q5D.
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It has been tried to provide the applied examples and standard operating procedures of celluar safety test and genetic stability tests for the CHO cell and H.polymorpha which expresses recombinant-DNA derived pharmaceuticals based on ICH (International Committee of Harmonization) Guideline Q5D.
The evaluation of safety and stability of cell substrate in the production of cells for the manufacturing of recombinant-DNA derived pharmaceuticals, and the review of genetic stability at DNA and RNA levels are very important factors as well as good manufactured products.
And systematic control of the cell which expresses recombinant-DNA derived pharmaceuticals is required during the manufacturing as well as after then.
Therefore, we would like to suggest the microbe and viral safety validation procedures and systematic control model of genetic stability of the cell for manufacturing of recombinant-DNA derived pharmaceuticals in this project.
Tests for contamination of bacteria, mycobacteria, adventitous virus, retrovirus were carried out firstly and then viability and cell growth kinetics were carried out.
The sequence analysis, genetic type test by restriction mapping, copy number test, RT-PCR test, northern blot were conducted at DNA and RNA levels.
Finally, productivity and western blot were tested at protein level. The tests include more detail information at protein level in comparison with stability test of product.
Assurance of genetic stability of cell substrate affects the quality, stability and productivity of biotech pharmaceuticals fundamentally.
We wish that this result will be a guide to help the Korean industry develop biotech pharmaceuticals efficiently.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 용역연구개발사업최종보고서 ...4
• 제출문 ...5
• 연구사업 최종보고서 요약문 ...6
• 국문요약문 ...6
• 영문요약문 ...7
• 목차 ...8
• 제1장 서론 ...9
• 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...9
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...11
• 제1세부과제 : 재조합 CHO 세포를 이용한 세포기질의 보존 및 평가시스템 확립 ...11
• 제1절 세포의 안전성에 관한 연구 ...11
• 제2절 세포의 안정성에 관한 연구 ...45
• 제3절 재조합 단백질의 특징 및 구조 유전자 검증 ...55
• 제4절 세포 활성유지 보존 방법에 대한 검증 ...88
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...96
• 1. 연구목표 달성도 ...96
• 2. 대외기여도 ...96
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...97
• 1. 계량적 성과 ...97
• 2. 성과내용기술 ...97
• 3. 활용계획 ...97
• 제6장 기타 중요변경사항 ...98
• 제7장 참고문헌 ...98
• 제2세부과제 : 재조합 H. polymorpha YU305를 이용한 cell banking system의 구축에 관한 연구 ...101
• 제1장 서론...101
• 제1절 Cell banking system 개발 목적 및 도입 필요성 ...101
• 제2절 모델 시스템으로서 H. polymorpha ...103
• 제3절 생물의약품의 제조에 사용되는 세포기질 (cell substrate)의 characterization 과 그 cell banking system 에 대한 국제적 가이드라인 ...106
• 제4절 Cell banking system의 구축 및 절차 ...108
• 제2장 연구개발 수행 내용 및 결과 ...109
• 제1절 구축된 Cell bank의 Characterization 및 정기적 시험 ...109
• 제2절 Cell bank의 Characterization 및 그 결과 ...110
• 제3절 Cell bank에 대한 정기적 관리시스템 ...154
• 제3장 연구개발 목표 달성도 및 대외 기여도 ...170
• 제4장 참고문헌 ...172
• 제1세부과제 재조합 CHO 세포를 이용한 세포기질의 보존 및 평가시스템 확립 ...173
• 목차 ...174
• 제1장 서론 ...175
• 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...175
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...177
• 제1세부과제 : 재조합 CHO 세포를 이용한 세포기질의 보존 및 평가시스템 확립 ...177
• 제1절 세포의 안전성에 관한 연구 ...177
• 제2절 세포의 안정성에 관한 연구 ...211
• 제3절 재조합 단백질의 특징 및 구조 유전자 검증 ...221
• 제4절 세포 활성유지 보존 방법에 대한 검증 ...254
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...262
• 1. 연구목표 달성도 ...262
• 2. 대외기여도 ...262
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...263
• 1. 계량적 성과 ...263
• 2. 성과내용기술 ...263
• 3. 활용계획 ...263
• 제6장 기타 중요변경사항 ...264
• 1. 회사 상호 변경...264
• 제7장 참고문헌 ...264
• 제2세부과제 최종 결과 보고서 - 재조합 H. polymorpha YU305를 이용한 cell banking system의 구축에 관한 연구 ? 백신연구소, 녹십자 백신 ...267
• 목차 ...268
• 제1장 서론 ...270
• 제1절 Cell banking system 개발 목적 및 도입 필요성 ...270
• 제2절 모델 시스템으로서 H. polymorpha ...272
• 1. Host ...272
• 2. 재조합 H. polymorpha ...274
• 제3절 생물의약품의 제조에 사용되는 세포기질 (cell substrate) characterization 과 그 cell banking system 에 대한 국제적 가이드라인...275
• 제4절 Cell banking system의 구축 및 절차 ...277
• 제2장 연구개발 수행 내용 및 결과 ...278
• 제1절 구축된 Cell bank의 Characterization 및 정기적 시험...278
• 제2절 Cell bank의 Characterization 및 그 결과 ...279
• 1. 구축된 Cell bank의 Characterization 항목 ...279
• 2. 결과 및 고찰 ...280
• 3. 10세대 및 100세대 배양물로부터 균체 펠렛 제조 ...281
• 4. 삽입된 플라스미드의 복제수 결정 ...283
• 5. 삽입 플라스미드의 identity 확인 ...287
• 6. 삽입된 HBsAg 유전자의 DNA 서열확인 ...299
• 7. 플라스미드의 삽입증거 ...308
• 8. 플라스미드의 삽입위치 확인 ...312
• 9. Mitotic stability의 증거 ...318
• 10.HBsAg mRNA identity 확인 ...319
• 제3절 Cell bank에 대한 정기적 관리시스템 ...323
• 1. Cell banking 관리시스템 ...323
• 2. MCB001에 대한 정기적 시험 ...325
• 3. Viability (생존율 확인시험) ...327
• 4. Microbial Purity (미생물적 순도 확인시험) ...328
• 5. 재조합 H. polymorpha YU305의 identity-Species identification ...331
• 6. 재조합 H. polymorpha YU305의 identity-HBsAg producer ...333
• 7. Stability- HBsAg 발현율 ...335
• 8. Stability-최대 균체농도 ...337
• 9. Stability --플라스미드 보유율 ...337
• 제3장 연구개발 목표 달성도 및 대외 기여도 ...339
• 제4장 참고문헌 ...341
• 총괄 연구과제 요약 ...342