초록 ▼

재조합 당단백질의 당화구조는 약물의 약동력학적 특성 및 안정성 등에 영향을 미치는 중요한 인자이므로 공정 및 품질의 평가에 반드시 고려되어야 한다. 본 연구에서는 제1차년도 과제 수행 항목 중 Differential de-glycosylation 시험법에서 확인되었던 부밴드 생성 현상을 전 처리 과정에 사용하는 Detergent의 선정 작업 등 최적화 과정을 수행함으로써 해결하였으며, Sialic acid와 관련한 시험항으로 인체 내에서 발현되지 않는 Sialic acid의 형태인 N-glycolylneuraminic acid의 검

재조합 당단백질의 당화구조는 약물의 약동력학적 특성 및 안정성 등에 영향을 미치는 중요한 인자이므로 공정 및 품질의 평가에 반드시 고려되어야 한다. 본 연구에서는 제1차년도 과제 수행 항목 중 Differential de-glycosylation 시험법에서 확인되었던 부밴드 생성 현상을 전 처리 과정에 사용하는 Detergent의 선정 작업 등 최적화 과정을 수행함으로써 해결하였으며, Sialic acid와 관련한 시험항으로 인체 내에서 발현되지 않는 Sialic acid의 형태인 N-glycolylneuraminic acid의 검출 방법을 확립하였다. 또한 본 과제 수행과는 별도의 시험 추진 과정에서 유럽약전 에리스로포이에틴 원액 항에 수재된 Sialic acid 함량 시험법 (Colorimetric detection using resorcinol reagent) 적용 시 Sialic acid 표준액 및 검액의 흡광 반응이 낮게 나타남으로 인하여 시험의 정확도가 저하되는 문제점을 5cm 길이의 cuvette을 도입함으로써 해결하였다. 올리고당 구조체 분석에 있어서는 형광 표지 분석법과 HPAEC-PAD를 활용한 분석법간 효율 차이를 확인하고, 확인시험항으로서 각각의 분석법에 대한 Method validation을 완결하였으며 재조합인 에리스로포이에틴과 재조합 난포자극호르몬 등 대표적 당단백질 의약품에 적용하여 시험법으로서의 타당성을 확인하였다. 분리 방법과 검출 특성을 달리하는 올리고당 분석법들에 대한 비교 결과 HPAEC-PAD 분석은 표지 과정을 생략할 수 있다는 장점에도 불구하고 검출기 및 분리기기의 불안정성으로 인하여 보편적인 활용에 있어 다소간의 제약이 있는 것으로 평가되었으며 2-AB(aminobenzamide)를 형광 표지 인자로 부착하여 HPLC를 통해 올리고당을 분리 및 검출하는 방법이 MALDI-tof 등 추가적인 구조 확인을 위한 MS. 분석에 매우 유용한 분석법이라는 사실을 확인하였다. 또한 재조합 당단백질 의약품에 있어, 일반적으로 알려진 구조적 형태에 Sulfation 및 Phosphorylation 등으로 변형된 구조체들이 미량 존재하는 것을 재조합 인 에리스로포이에틴의 유럽 약전 표준품으로부터 확인하였다.

Abstract ▼

Carbohydrate structures should be considered in the evaluation of the quality and process of the recombinant therapeutic glycoproteins proteins, since they are regarded as key factors affecting pharmacokinetic profile and stability of the proteins. In this second year on-going studies, the different

Carbohydrate structures should be considered in the evaluation of the quality and process of the recombinant therapeutic glycoproteins proteins, since they are regarded as key factors affecting pharmacokinetic profile and stability of the proteins. In this second year on-going studies, the differential de-glycosylation method was optimized to display apparent single bands in a SDS-PAGE gel by superseding ineffective detergent solutions for the glycosidase arrays. For the sialic acid determination, a method for separation of N-glycolylneuraminic acid was established and the colorimetric detection method using resorcinol reagent (EP method) was also established as a robust method by introducing 5cm path-length cuvette to increase the absorbancies. For the oligosaccharide profiling methods, each of two different analysis methods using HPAEC-PAD system and NP-HPLC/FLD system was established and validated with the oligosaccharide standards and model recombinant glycoproteins such as erythropoietin and follicle stimulating hormone. Though some advantages in the HPAEC-PAD method of good resolution and easy sample preparation, the 2-AB tagging method was evaluated more reliable and robust as common analysis method, since there was no significant variance in retention time and area of each peaks identified on run-to-run basis. The 2-AB method has advantage of providing glycans with additional chromophore in a MS. analysis. The method to identify unusual structural modification on the glycan structures were also studied. As a result sulfated and/or phosphorylated glycan structures was identified in a trace amount from the EPO BRP by separating the de-sialylated N-glycans on the GlycoSep C column.

목차 Contents

• 용역연구개발사업최종보고서 ...1
• 표지 ...3
• 제출문 ...7
• 요약문 ...9
• Project Summary ...11
• 목차 ...13
• 제1장 서론 ...15
• 제1절 재조합 당단백질 의약품의 개발 현황 및 전망 ...15
• 제2절 재조합 당단백질 의약품의 생산 공정 변화 동향 ...15
• 제3절 재조합 당단백질 의약품에 있어 당구조에 대한 품질 평가의 관점 ...16
• 제2장 국내.외 기술개발 동향 ...18
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...21
• 제1절 연구개발 수행 내용 요약 ...21
• 제2절 연구 내용 ...21
• 1. 당단백질의 올리고당 가수분해 조건 탐색 ...21
• 2. NN-glycolylneuraminic acid(NGNA)와 N-acetylneuraminic acid(NANA) 등 Sialic acid 분리 방법 ...25
• 3. 유럽약전 에리스로포이에틴 원액항의 Sialic acid 함량 시험법 문제점 해결 ...26
• 4. 형광물질을 이용한 올리고당 표지 분석법 평가 ...28
• 5. HPAEC-PAD (BioLC) 시스템을 이용한 당단백질 올리고당의 분석법 ...51
• 6. 올리고당 변형체의 분석 ...71
• 별첨 1. 2-AB를 이용한 올리고당 조성 분석법의 표준 작업 절차 및 분석법 밸리데이션 프로토콜 ...74
• 별첨 2. HPAEC-PAD 시스템을 이용한 중성 올리고당 조성 분석법의 표준 작업 절차 및 분석법 밸리데이션 프로토콜 ...81
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...87
• 제5장 연구개발결과의 활용 계획 ...88
• 제6장 기타 중요변경사항 ...89
• 제7장 참고문헌 ...90
• 총괄 연구고제 요약 ...177