초록 ▼

본 연구는 감귤류식물의 분자육종방법 확립 및 병해충 저항성 감귤 개발에 목표를 두고 제1세부과제: 감귤형질전환계 연구 및 B.t. toxin 유전자를 이용한 내충성 감귤품종 개발, 제2세부과제: Phytoecdysteroid 유전자를 이용한 광범위 내충성 감귤품종 개발, 제3세부과제: 바이러스 저항성 감귤품종 개발 등 3개의 세부과제로 나누어 수행하였다. 제1세부과제는 크게 감귤의 형질전환계 확립 연구와 B.t. toxin 유전자를 이용한 내충성 감귤개발 연구로 구분된다. 형질전환계 연구에서는 먼저 오렌지를 비롯한 일반 감귤류 뿐만

본 연구는 감귤류식물의 분자육종방법 확립 및 병해충 저항성 감귤 개발에 목표를 두고 제1세부과제: 감귤형질전환계 연구 및 B.t. toxin 유전자를 이용한 내충성 감귤품종 개발, 제2세부과제: Phytoecdysteroid 유전자를 이용한 광범위 내충성 감귤품종 개발, 제3세부과제: 바이러스 저항성 감귤품종 개발 등 3개의 세부과제로 나누어 수행하였다. 제1세부과제는 크게 감귤의 형질전환계 확립 연구와 B.t. toxin 유전자를 이용한 내충성 감귤개발 연구로 구분된다. 형질전환계 연구에서는 먼저 오렌지를 비롯한 일반 감귤류 뿐만아니라 감귤류 중에서 국내에서 가장 중요한 온주밀감에 대해 캘러스 유기, 증식, 식물체 재분화 조건사 등 감귤 분자육종의 선결과제인 조직배양계의 확립과 관련된 실험을 수행하였다. 또 형질전환식물체의 확보를 위해 필요한 어린 감귤식물체의 증식 방법을 모색하였다. 그리고 세포내에 유전자를 도입하는 방법으로서 미세입자투사법(microprojectile bombardment), agrobacterium법, silicon carbide fiber 법 등 3가지를 검토하고, 형질전환체의 선발 및 식물체 재분화 조건을 조사하였다. B.t.유전자에 의한 내충성 감귤개발 연구에서는 딱정벌레목과 나비목에 대해 각각 살충성을 가진 Cry IIIA와 Cry IA 유전자를 확보하고 오렌지와 온주밀감에 도입하여 형질전환 식물체를 만들고 도입유전자의 확인 및 내충성 조사 실험을 수행하였다. 제2세부과제에서는 ecdysteroid의 생합성 유전자를 도입하여 내충성 감귤을 만드는데 목적이 있는데 이 유전자를 식물에 도입하면 대부분의 곤충에 있어서 탈피호르몬 활성을 나타내는 ecdysteroid가 식물체내에서 과잉합성되어 광범위한 해충에 대해 저항성을 나타낼 것으로 기대된다. 그러나 아직 ecdysteroid 합성 유전자가 분리되어 있지 않기 때문에 이 연구는 유전자분리를 위한 기초실험부터 시작하였다. Ecdysteroid는 비록 곤충호르몬이지만 식물에서도 합성되는 것으로 알려져 있어서 ecdysteroid 분석을 통해 ecdysteroid 합성능력이 우수하여 유전자를 분리하는데 유리한 유전자원식물을 선발하고, mRNA 또는 효소의 분리조건을 적정화하기 위해 식물의 ecdysteoid 합성을 증진시키는 요인들을 조사하고 조직배양 조건을 검토하였다. Ecdysteroid 유전자원 식물로부터 mRNA를 분리하고 cDNAlibrary를 만들어 RT-PCR에 의해 cDNA를 cloning하는 실험을 수행하였다. 그리고 Cloning된 cDNA의 염기 및 아미노산 서열의 분석을 통해 ecdysteroid 생합성계와의 연관성을 검토하였고 식물체 내에서 이 유전자의 발현과 ecdysteroid 합성과의 상관성을 조사하였다. 제3세부과제에서는 스템피팅병의 원인인 Citrus tristeza virus (CTV) 에 대해 저항성이 있는 감귤을 개발하는데 목적이 있는데, CTV의 외피단백질 유전자와 결손복제 유전자를 도입하여 바이러스저항성 식물체를 만들고자 하였다. 국내에서 재배되고 있는 CTV 감염 감귤로부터 RNA를 분리하여 PCR에 의해 cloning 하여 염기서열과 아미노산서열을 분석하여 유사 바이러스와 비교 분석하였다. 분리된 유전자를 Agrobacterium 또는 microprojectile bombardment 법으로 유자, 이예감, 삼보감, 오렌지에 도입하여 형질전환 식물체를 만들었다. 그리고 이들 형질전환 식물에 대해 도입유전자의 DNA를 확인하고, mRNA 분석을 통해 식물체 내에서 도입 유전자의 발현을 조사하였다. 또한 현재 국내에서 재배되고 있는 감귤나무를 대상으로 CTV 감염현황을 RT-PCR에 의해 조사하고 CTV 감염을 진단할 수 있는 항체의 제조 실험을 수행하였다.

Abstract ▼

Molecular breeding method is a powerful technique for introducing new traits into plants. This technique can be adopted also inbreeding of citrus species. The process in moleclar breeding consistsf DNA introduction into plant cells, transformant screening, plant regeneration from transformed cells.

Molecular breeding method is a powerful technique for introducing new traits into plants. This technique can be adopted also inbreeding of citrus species. The process in moleclar breeding consistsf DNA introduction into plant cells, transformant screening, plant regeneration from transformed cells. The establishment of tissue culture system including callus induction, somatic embryogenesis ororganogenesis, plant regeneration is prerequisite for successful transformation. However, citrus is known to be recalcitrant specieswhich are difficult to regenerate plants by cell or tissue culture.Citrus unshiu, the most imortant crop in Cheju, is especiallyrecalcitrant among citrus species.
The goals of this study are to develope transformation systems for molecular breeding of citrus species and to construct transgenic plants resistant against insect pests and viruses. We investigated the conditions for callus induction, somatic embryogenesis, organogenesis, plant regeneration of several citrus species including Citrus unshiu and established the optimal tissue culture system foreach species. Microprojectile bombardment, agrobacterium and carboncarbide fiber systems were examined as gene introduction methods forcitrus transformation. We could obtain transformants with these threemethods, however, microprojectile bombardment system was most efficient.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 요약문 ...3
• SUMMARY ...9
• CONTENTS ...12
• 목차 ...17
• 제 1 장 서 론 ...21
• 제1절 연구개발의 배경 ...21
• 1. 병해충저항성 감귤개발의 필요성 ...21
• 2. 감귤육종에 관한 연구현황 ...23
• 제2절 연구개발의 목적과 범위 ...25
• 1. 연구목적 ...25
• 2. 연구범위 ...26
• 제 2 장 감귤류 식물의 형질전환계 확립 ...28
• 제1절 서 설 ...28
• 제2절 감귤류 식물의 조직배양 및 증식 ...31
• 1. 일반 감귤류의 조직배양계 ...31
• 2. 온주밀감의 조직배양계 ...41
• 3. 기내배양 식물체의 증식 ...47
• 제3절 감귤류식물 형질전환 방법 ...49
• 1. 미세입자투사에 의한 형질전환계 ...49
• 2. Ag robacterium 매개 형질전환계 ...53
• 3. Carbon carbide fiber를 이용한 형질전환계 ...55
• 제4절. 참고문헌 ...56
• 제 3 장 B.t. 독소유전자를 이용한 내충성 감귤개발 연구 ...61
• 제1절 서 설 ...61
• 제2절 B.t. 독소유전자의 클로닝 (Cry IIIA) ...64
• 1. 유전자의 분리 ...64
• 2. E.coli에서 유전자의 발현 ...66
• 3. 발현된 유전자 산물의 살충성 ...68
• 4. 유전자의 염기서열 ...70
• 5. 감귤형질전환용 벡터구성 ...72
• 6. Gene/vector 클로닝 ...73
• 제3절 B.t. 독소(Cry IIIA) 유전자에 의한 Ponkan 형질전환 ...76
• 1. 형질전환 ...76
• 2. 형질전환식물의 도입유전자 확인 ...77
• 3. 형질전환식물의 도입유전자 발현 ...77
• 4. 형질전환식물의 내충성 조사 ...78
• 제4절 B.t. 독소(Cry IIIA) 유전자도입 오렌지류 형질전환 ...81
• 1. 형질전환 ...81
• 2. 형질전환식물의 도입유전자 확인 ...83
• 3. 형질전환식물의 증식 ...85
• 제5절 B.t. 독소(Cry IA) 유전자도입 온주밀감 형질전환 ...87
• 1. 유전자의 식물발현벡터내 구성 ...87
• 2. 형질전환 ...88
• 3. 형질전환식물의 도입유전자 확인 ...90
• 4. 형질전환식물의 내충성 조사 ...91
• 제6절. 참고문헌 ...92
• 제 4 장 Phytoecdys teroid 생합성 유전자를 이용한 내충성 감귤개발 연구 ...94
• 제1절 서 설 ...94
• 제2절 유전자원식물 ...100
• 1. Phytoecdys teroid 분석법 확립 ...100
• 2. 유전자원식물 선발 ...108
• 3. 유전자원식물 조직배양계 확립 ...112
• 제3절 Phytoecdys teroid 생합성에 관여하는 인자 ...116
• 1. 광도 ...116
• 2. 식물생장조절물질의 농도 ...118
• 3. 식물생육단계 ...120
• 4. 식물체조직부위 ...120
• 제4절 Phytoecdys teroid 생합성 효소분리 실험 ...125
• 1. 식물시료의 phytoecdys teroid 동정 ...125
• 2. 14C 표지 전구물질의 ecdys teroid로의 전환 ...125
• 3. 14C 표지 전구물질을 이용한 효소활성 측정 ...129
• 4. 중수소표지 전구물질을 이용한 효소활성 측정 ...131
• 제5절 RT - PCR에 의한 phytoecdys teroid 생합성 유전자 분리 ...132
• 1. mRNA 분리 및 cDNA library 제작 ...132
• 2. RT - PCR primer 제작 ...135
• 3. 부분 cDNA 클로닝 ...139
• 4. 부분 cDNA의 염기서열 결정 ...142
• 5. 관련 유전자와의 상동성 분석 ...146
• 6. 유전자발현과 phytoecdys teroid 함량의 상관성 ...150
• 7. 전체 cDNA 클로닝 ...151
• 제6절 참고문헌 ...155
• 제 5 장 바이러스(CT V) 저항성 감귤개발 연구 ...164
• 제1절. 서설 ...164
• 제2절. 제주도내 재배감귤의 CT V 감염실태 ...168
• 1. 감귤잎 시료 채취 ...168
• 2. RT - PCR에 의한 CT V 진단법 개발 ...169
• 3. 제주도내 감귤의 CT V 감염실태 ...170
• 4. 혈청법에 의한 CT V 진단용 항체 제조 ...173
• 제3절. CT V의 외피단백질 유전자와 결손복제 유전자 클로닝 ...175
• 1. Primer 설계 및 합성 ...175
• 2. CT V 감염 감귤잎의 전체 RNA 분리 ...178
• 3. RT - PCR을 이용한 외피단백질 유전자의 합성 ...178
• 4. 외피단백질 유전자의 클로닝 ...178
• 5. 외피단백질 유전자의 염기서열 결정 ...179
• 6. RT - PCR을 이용한 결손복제 유전자의 합성 ...180
• 7. 결손복제 유전자의 클로닝 ...181
• 8. 결손복제 유전자의 염기서열 결정 ...182
• 제4절. CT V 유전자도입에 의한 감귤형질전환 ...185
• 1. 식물발현벡터내에 유전자의 클로닝 ...185
• 2. 결손복제 유전자 도입 감귤형질전환 ...187
• 3. 외피단백질 유전자 도입 감귤형질전환 (Agrobacterium법) ...188
• 4. 외피단백질 유전자 도입 감귤형질전환 (미세입자투사법) ...190
• 제5절. 참고문헌 ...197