초록 ▼

Ⅰ. 연구개발의 목적 및 필요성
- 유전체의 안정성(Genome Stability)은모든 생명체의 생존과 기능 유지에 필수 요인임.
- 다양한 염색체 이상 원인 중DNA 이중나선 손상(DSB, DNA double-strand break)이 제대로 수선되지 않을 경우 유전자의 기능에 심각한 영향을 끼칠 수 있음.
- DSB 수선 단백질 Ku70, Ku80는 DNA에 직접 결합하여 DNA-dependent protein kinase(DNA-PK)를 불러들이고 활성을 조절하는 역할과 독립적인 DNA 수선 기능 및 세포 증

Ⅰ. 연구개발의 목적 및 필요성
- 유전체의 안정성(Genome Stability)은모든 생명체의 생존과 기능 유지에 필수 요인임.
- 다양한 염색체 이상 원인 중DNA 이중나선 손상(DSB, DNA double-strand break)이 제대로 수선되지 않을 경우 유전자의 기능에 심각한 영향을 끼칠 수 있음.
- DSB 수선 단백질 Ku70, Ku80는 DNA에 직접 결합하여 DNA-dependent protein kinase(DNA-PK)를 불러들이고 활성을 조절하는 역할과 독립적인 DNA 수선 기능 및 세포 증식/사멸에 관여하며 유방암의 경우 발현량이 증가함.
- DNA-PK는 세린/쓰레오닌 인산화 효소로 핵에 존재하고 있으며 대부분의 암세포에서는 Ku80와 동시에 발현되며 DNA-PK가 결실된 세포에서는 ionizing radiation에 대하여 민감하여 DSB가 잘 일어남. 또한 전사, 세포사멸, telomere 길이조절에도 중요한 역할을 하고 있음.
- 히스톤 H2AX는 진핵생물에 존재하는 H2A의 변형으로 DNA의 손상이나 세포사멸시 인산화 형태의 gamma-H2AX로 검출됨
- 이러한 DSB의 수선 기작을 위암 세포를 대상으로 연구하여 실제로 일어나 있는 DSB를 활용하여 궁극적으로 발암 기작 규명 및 이 연구 결과를 통한 발암 진단 마커의 발굴을 목표로 하고 있음.
- DSB를 이용한 발암 진단은 아직까지 수행되지 않은 연구 분야 중 하나로 성공할 경우 사회,경제적 파급효과가 클 것을 기대됨

Ⅱ. 연구개발의 내용 및 범위
- 위암을 대상으로 DNA 수리에 관여하는 Ku70, Ku80, DNA-PKcs 단백질들의 실제 발현 양상을 조사함.
- 위암 세포에서 이들 단백질들이 실제로 DNA 이중나선 손상 부위에 결합하고 있는 모든 위치를 차세대 염기서열 분석 장비를 이용하여 확인.
- DNA 이중 나선 손상 부위에는 히스톤 단백질 중 H2A 대신 인산화된 히스톤 단백질 gamma-H2AX로 치환된 경우가많이 관찰되는데 우선 gamma-H2AX의발현 양상을 조사하고 이들의 위치를 전체 유전체상에서 확인하고 Ku70, Ku80, DNA-PKcs의 결합 위치와 상호 비교 분석을 통하여 공통적으로 결합한 위치의 경우DSB일 가능성이 높으므로 이들을 동정하고자 함.
- 동정된 위암 특이적 DNA 이중나선 손상 위치로 부터 인접한 유전자의 상호 관련성 규명 및 발암 진단 마커의 발굴코자 함.

Ⅲ. 연구개발결과
- 두 종류의 위암 세포주, KATOIII (diffuse type)과 SNU484 (intestinal type)를 대상으로 DNA 손상회복에 관여하는 Ku70, Ku80, DNA-PK, XRCC4 등의 발현 양을 Western blot 및 Immunostaing으로 확인함.
- 크로마틴 면역침전법(ChIP)을 이용하여 Ku70, Ku80, DNA-PK, XRCC4 단백질들이 결합하고 있는 DNA 부분을 회수하고 PCR로 확인함.
- RNA 전사 패턴을 RAN-Seq 방법으로 확인하고자 mRNA 시퀀싱 라이브러리를 두 종류의 세포에서 제작함.
- 인산화된 히스톤 단백질 gamma-H2AX가 존재하는 위치를 확인하기 위하여 ChIP을 수행하였고 gamma-H2AX가 세포 주기에 따라 발현 양이 변화하는지 immunohistochmeistry를 이용하여 관찰함.
- 전체 유전체에 분포하는 상기 단백질들의 매핑을 위해 ChIP을 통하여 회수한 DNA의 순도를 높이고 noise 제거를 위한 실험을 수행중에 있음.

Ⅳ. 연구개발결과의 활용계획
- 본 연구는 발암의 여러 요인 중 DNA 손상에 의한 기전 규명을 통하여 학문적으로 암의 정복을 위한 새로운 시도로 최종 연구 내용을 완성할 경우 경제.산업적으로 유용한 발암 진단 마커 발굴에 응용할 수 있음.

Abstract ▼

Ⅰ. Research purpose
- The genome stability is an essential factor to survive and maintain the cellular function. One of major abnormality in the chromosome is DNA double strand break (DSB). DSB poses a severe threat to genome stability, since improper repair could cause loss of chromosome fragmen

Ⅰ. Research purpose
- The genome stability is an essential factor to survive and maintain the cellular function. One of major abnormality in the chromosome is DNA double strand break (DSB). DSB poses a severe threat to genome stability, since improper repair could cause loss of chromosome fragments during mitosis or wrong coupling.
- The DSB repair proteins, Ku70 and Ku80 forms a heterodimer and can bind directly to the DSB DNA. They recruit DNA-dependent protein kinase(DNA-PK). The assembly of DNA-PK complex then acquire the ability to phosphorylate a number of target proteins. Especially in breast cancer cells, the expression level of DNA-PK was increased.
- DNA-PK is a serine/threonine phosphorylase located in the nucleus. Most cancer cells express DNA-PK together with Ku80. The deletion mutant of DNA-PK is sensitive to ionizing radiation and thus is susceptible to DSB.
- Gamma-histone H2AX is a phosphorylated form of histone H2AX, which is replaced with regular histone H2A when the DSB occur.
- By utilizing repair mechanism for DSB, we tried to understand to find a new mechanism through mapping of DSB-related proteins and to suggest diagnostic markers for cancer.

Ⅱ. Contents and Scope of research
- The genome-wide position of DSB repair system related proteins such as Ku70, Ku80, and DNA-PKcs in gastric cancer cells will be mapped using next-generation sequencing technique
- The position of gamma-H2AX in the gastric cancer cells will be identified in the whole genome and compare with DSB repair protein binding.
- Gastric cancer-specific DSB positions will be applied to identification of genes at the DSB sites and development of cancer diagnositic marker.

Ⅲ. Research result
- Two type of gastric cancer cell lines, KATOIII (diffuse type) and SNU484 (intestinal type) was used to check the expression level of Ku70, Ku80, DNA-PK, and XRCC4 by Western blot as well as Immunostaing.
- Using chromatin immunoprecipitation (ChIP), the DNA fragment bound to Ku70, Ku80, DNA-PK, and XRCC4 was recovered and verified by target specific PCR.
- To examine the mRNA transcription patterns of KATOIII and SNU484 cells, total RNA was isolated and mRNA sequencing libraries were prepared for the RNA-Seq analysis.
- To map the global position of gamma -H2AX, ChIP was performed and verified. Using immunohistochmeistry, the variation of gamma-H2AX levels in the cell cycle was also examined.
- Currently we are reducing the background noise and increaing the purity of ChIP-ed DNA to SUMMARY apply them to the next-generation sequencing.

Ⅳ. Plan for utilizing the result
- This project aims to explain a mechanism that DNA double strand break point might be cancer-type specific and mapping of DSB sites could provide clues for developing new diagnositc markers.

목차 Contents

• Ⅰ. 총괄현황 ...1
• 1. 겉표지 (앞면) ...2
• 2. 제출문 ...4
• 3. 보고서 요약서 ...5
• 4. 요약문 (한글) ...6
• 5. 요약문 (영문) ...8
• 6. 연구 성과 실적 및 향후 계획 ...10
• 7. 참여연구원 현황표 ...14
• Ⅱ. 총괄연구과제 연구결과 ...15
• 1. 연구개발과제의 배경 및 필요성 ...16
• 2. 국내외 기술개발 현황 ...20
• 3. 연구개발과제의 추진체계 ...20
• 4. 연구개발수행 내용 및 결과 ...23
• 5. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ...33
• 6. 향후 연구성과 추진 계획 ...35
• 7. 연구개발결과의 파급효과 ...35
• 8. 연구개발결과의 활용계획 ...37
• 9. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...37
• 10. 참고문헌 ...37
• Ⅳ. 첨부서류 ...40
• 1. 자체평가의견서 ...42
• 2. 실적 증빙자료 ...46
• 3. 기타 첨부서류 ...46