초록 ▼

◆ 연구목표
<최종목표>
항원 특이적 CD8 T 세포를 이용한 암세포 치료제 개발 및 임상실험
<당해연도목표>
1. GMP 시설 구축
2. 면역 억제기능 제거를 통한 항암효과 증진기작 규명
◆ 연구내용 및 방법
1. GMP 시설 기반 구축
치료용 항암 CTL 세포를 생산하기 위한 GMP 시설 구축의 준비 작업을 수행함. GMP 시설을 위한 공간 및 인력 충원 계획을 확립함. GMP 시설을 위한 준비 위원회를 결성하고 개념 설계 및 시공자 선정의 계획을 확립함. 새로이 발족한 면역/세포 치료

◆ 연구목표
<최종목표>
항원 특이적 CD8 T 세포를 이용한 암세포 치료제 개발 및 임상실험
<당해연도목표>
1. GMP 시설 구축
2. 면역 억제기능 제거를 통한 항암효과 증진기작 규명
◆ 연구내용 및 방법
1. GMP 시설 기반 구축
치료용 항암 CTL 세포를 생산하기 위한 GMP 시설 구축의 준비 작업을 수행함. GMP 시설을 위한 공간 및 인력 충원 계획을 확립함. GMP 시설을 위한 준비 위원회를 결성하고 개념 설계 및 시공자 선정의 계획을 확립함. 새로이 발족한 면역/세포 치료과를 위한 기기 및 소모품 발주를 완료함. Korea-Japan Translational Research Conference를 12월 1일 본 국립 암센터에서 개최.
2. 면역억제기전 제거를 통한 CD8 T 항암효과 증진기작 연구
본 연구는 환자로부터 분리한 면역세포 중 시험관내에서 항원 특이적 CD8 T 세포 (CTL)를 대량 생산하여 암환자에게 투여함으로써 항암반응을 증진시켜 암을 치료하는 것을 목표로함. 자가 유래 CD8 T 세포를 이용한 암 치료 방법은 오랜 역사를 가진 연구 분야이며, 암 항원 특이적 CD8 T 세포를 형성하기 위한 다양한 방법들이 연구됨. 특히 오랜 임상실험을 통해 안전한 면역치료방법임이 증명되어 왔으며, 최근에는 CD8 T 세포치료법을 임상적용시 가장 문제가 되었던 투여된 CTL 세포의 생체내 증식을 강력하게 유도할 수 있는 방법들이 알려짐. 따라서 최근 CTL 세포치료은 다양한 adoptive cell therapy 중 가장 안전하며 효과적인 암치료법으로 증명되었음.
최근의 연구보고들은 암세포가 증식하는 과정에서 다양한 방법을 통해 면역반응을 억제함을 보고. 이로 인해 암치료를 위해 사용하는 면역세포들은 환자의 몸속에서 충분히 역할을 하지 못하는 경우가 발생하며, 특히 이미 암 조직이 넓게 형성된 암환자에게 시험관내에서 증식시킨 CTL을 대량 투여할 경우, 이들은 충분한 항암반응을 유도하지 못하는 경우가 발생하게됨.
암세포 증식에 따른 항암 면역반응 억제현상에 관한 집중적인 연구를 통해, 암세포에 의한 면역억제 기전과 CTL 치료법이 생체 내에서 낮은 효율을 나타내는 원인이 밝혀졌음. 암세포는 증식과정동안 면역 억제를 유발하는 CD4+CD25+ regulatory T 세포 (Treg)를 암 조직내에 선택적으로 축적시키며, 또한 tumor draining lymph node (TDLN)내에 indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)를 발현하는 수지상세포를 증가시켜 항암 T 세포반응을 억제. 따라서 암 조직이 형성된 환자는 항암반응을 유도가 저해됨. 이러한 암 조직에 의한 면역억제기전을 제거할 경우, CTL 세포치료의 효율증대를 규명할 필요가 있음.
따라서 본 연구에서는 암세포에 의한 면역억제기전을 제거할 수 있는 방법을 연구하였으며, 그 결과로 anti-CD4 항체를 이용하여 CD4 양성인 세포를 제거함으로써 CD4를 발현하는 Treg 및 IDO를 발현하는 수지상세포의 대부분을 제거할 수 있으며, 이를 통해 항암 면역반응을 증진시킬 수 있음을 연구하였음. 또한 CD4 T 세포 제거를 통해 부분적인 lymphopenia를 유도함으로써 항원 특이적 CD8 T 세포의 증식을 더욱 증가시켜 항암 면역반응을 유도할 수 있음을 증명. 따라서 anti-CD4 항체와 함께 CD8 T 세포의 반응을 선택적으로 유도할 수 있는 anti-4-1BB 항체로 암을 복합치료 함으로써, 암세포에 의한 면역억제기전을 극복할 경우 CD8 T 세포에 의한 항암반응을 극대화 할 수 있음을 증명하였음.
본 연구결과는 암세포에 의한 면역억제기전의 제거 및 lymphopenia를 유발함이 CTL 세포치료 효과를 증가시킴을 증명함.
연구방법
1. 암 모델 및 항체치료: 쥐에 $4x10^{5}$ B16F10 흑색종을 등 중앙 부위에 피하주사. 쥐에게 암 세포를 주사함과 동시에 100㎍의 항 4-1BB 단일 항체 (3E1) 그리고/또는 400㎍의 anti-CD4 단일 항체 (GK1.5)를 5일마다 복강주사. 각 시간대 별로 암의 성장을 관찰하고 암의 크기를 각 그룹에서 측정. 지연 치료에서 항암 효과를 보기 위해서는 암의 지름이 3-5mm가 되었을때부터 위와 같은 항체를 가지고 치료.
2. 세포 증식의 분석: 생체내에서 세포의 증식을 측정하기 위해서, 암이 투여된 생쥐는 1mg BrdU (BD biosciences)를 가지고 복강 주사. BrdU를 주사한 뒤 1 시간 째 암 조직 근처의 림프절 (Inguinal lymph nodes)를 분리하고, 세포들은 PE-anti-CD4, -항 CD8, 또는 -항 B220 단독, 또는 PE-항 CD11c 그리고 PE-Cy5-항 CD8으로 표면을 염색.
3. 유세포 분석: 단일 세포 현탁액은 암 조직 근처의 림프절과 암 조직에서 분리되었다. 이러한 세포들은 표면 분자에 특이적인 항체를 가지고 염색되었다. 이렇게 준비된 시료들은 유세포 분석기 (Becton-Dickinson)를 사용하여 표면 분자 표현형을 분석되었다.
◆ 연구성과
<당해연도 성과>
-정량적 성과
<차기년도 목표 연구성과>
-정량적 성과

Abstract ▼

◆ Research purpose

Development of anti-cancer immunotherapeutics using antigen-specific CD8 T cells and its clincal application.

1. Establishment of GMP facility
2. Enhancement of anti-cancer immunity by removing tumor-mediated

◆ Research purpose

Development of anti-cancer immunotherapeutics using antigen-specific CD8 T cells and its clincal application.

1. Establishment of GMP facility
2. Enhancement of anti-cancer immunity by removing tumor-mediated immune suppression
◆ Results
1. Estabilishment of GMP facility
- Form a committee and draw up the plan to establish GMP facility including space, man power, and design of GMP facility.
- Place an order the equipments and basic supplies.
- Korea-Japan Translational Research Conference on Dec. 1, 2007.
2. Enhancement of anti-cancer immunity by removing tumor-mediated immune suppression
Immunotherapy is an approach to treating intractable diseases such as tumors, autoimmune diseases, transplantation rejection, and chronic infections by enhancing, suppressing, or modifying the immune system. Immunotherapy of cancer patient with antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) have been tested in clinic for several decades, but the therapeutic effects was not sufficient to completely treat the cancer patients.
Recent reports suggest that tumor cells actively induces the suppression of tumor-specific immune responses by massively increasing infiltration of $CD4^{+}$CD25+ regulatory T cells in tumor tissue and indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO)-expressing DCs in tumor-draining lymph nodes.
We describe here the therapeutic effect of an agonistic anti-4-1BB in combination with a depleting anti-CD4 monoclonal antibody (mAb) in a B16-F10 melanoma model.
We found that anti-4-1BB treatment resulted in the polyclonal expansion and differentiation of CD8+ T cells into effective tumor killers. CD4+ T-cell depletion facilitated the infiltration of immune cells into the tumors and removed regulatory barriers such as T regulatory (Treg) and IDO+ dendritic cells. Both mAbs contributed to creating a CD8+ T-susceptible tumor microenvironment by inducing class I molecules on the surface of the melanoma cells. These results indicate that the combination of the two mAbs, agonistic anti-4-1BB and depleting anti-CD4, results in enhanced production of efficient tumor-killing CTLs, facilitation of their infiltration, and production of a susceptible tumor microenvironment.
Taken together, these results suggest that the removal of tumor-mediated suppressive barriers and induction of transient lymphopenia would enhance the anti-tumor immunity of adoptively transferred CTLs in tumor patient.
3. 연구방법
Treatments. Mice were challenged s.c. on the back with 4 x 105 B16-F10 melanoma cells.
For preventative therapy, mice were injected i.p. with 100 μg anti-4-1BB and/or 400 μg anti-CD4 every 5 days. To deplete NK cells, tumor-bearing mice received 400 μg anti-NK1.1 i.p. every 5 days. For NKG2D blocking, mice were given 500 μg anti-NKG2D every 5 days. For assessing the antitumor effects of delayed therapy, mice were treated as described above when tumors were 3 to 5 mm in diameter.
Proliferation assay in vivo. Tumor-draining lymph nodes (TDLN) were harvested 1 h after injecting 1 mg BrdUrd into tumor-bearing mice. The cells were surface-stained with PE-conjugated anti-CD4, anti-CD8, or anti-B220 alone, or with PE-conjugated anti-CD11c and PE-Cy5？onjugated anti-CD8, and then fixed, permeabilized, and intracellularly stained with FITC-conjugated anti-BrdUrd (BD Bioscience).
Flow cytometry. Cells were incubated with the Fc blocker 2.4G2 for 10 min at 4°C and stained with specific antibodies to surface markers. The expression of MHC class I or IFN-{gamma}R on B16-F10 melanoma were determined by staining with PE-conjugated anti-H-2Kb, H-2Db, or IFN-{gamma}R as well as an FITC-conjugated anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD11c, anti-B220, anti-F4/80, anti-NK1.1, or anti-Gr-1. All samples were analyzed on a FACScalibur (BD Bioscience).
CD107 mobilization assay. CD107 mobilization was determined as described on TDLN-derived effector cells in the presence of tumor antigen-pulsed EL4 cells on propidium iodide (PI) day 15.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...3
• 목차 ...4
• < 요 약 문 > ...5
• 한글요약문 ...5
• 영문요약문 ...7
• 1. 연구사업의 최종목표 ...9
• 2. 연구사업의 내용 및 결과 ...9
• 3. 연구결과 고찰 및 결론 ...14
• 4. 연구성과 및 목표달성도 ...14
• 5. 연구결과의 활용계획 ...16
• 6. 참고문헌 ...17
• 7. 첨부서류 ...19