초록 ▼

면역글로불린제제의 B형간염 표면항원 항체가 역가시험인 미세입자고착 효소면역검사(MEIA)법에 대한 검정시약의 짧은 유효기간, 동시처리 검체수량의 제한 등의 단점을 해결할 수 있는 시험법 개선 필요에 따라 적합한 ELISA Kit 선정을통한 ELISA법 확립 및 MEIA 법과의 비교분석 및 제조사 등과의 공동연구를 통한 역가시험결과 비교 및 상관관계 분석에 의한 사람면역글로불린 제제에 대한 B형간염 표면항원 항체가 시험법 개선을 위한 연구가 수행되었다. 국내외에서 시판되어 사용되고 있는 ELISA Kit 후보중 스크리닝을 통하여 적합

면역글로불린제제의 B형간염 표면항원 항체가 역가시험인 미세입자고착 효소면역검사(MEIA)법에 대한 검정시약의 짧은 유효기간, 동시처리 검체수량의 제한 등의 단점을 해결할 수 있는 시험법 개선 필요에 따라 적합한 ELISA Kit 선정을통한 ELISA법 확립 및 MEIA 법과의 비교분석 및 제조사 등과의 공동연구를 통한 역가시험결과 비교 및 상관관계 분석에 의한 사람면역글로불린 제제에 대한 B형간염 표면항원 항체가 시험법 개선을 위한 연구가 수행되었다. 국내외에서 시판되어 사용되고 있는 ELISA Kit 후보중 스크리닝을 통하여 적합한 Kit를 선정하기위한 제조사 등과의 총 4개 실험실의 국가표준품 및 WHO 국제 표준품을 이용한 예비실험이 수행되었고, 총 1728개 data의 통계분석을 통해 정확성 (회수율 >96%) 및 정밀성 (CV 평균 5%)이 확인된 Enzygnost 키트를 선정하였으며, 희석 용액으로 키트에 포함된 음성혈장 혹은 사람혈청 알부민 5%가 사용가능함을 밝혔다. 예비실험을 통해 확립된 표준시험방법을 통해 4개 실험실에서 동일한 국가표준품 및 검체를 사용하여 MEIA법 및 ELISA법 을 각각 수행한 결과를 비교하고 시험타당성을 확인한 본실험에서 총 4312개의 data의 통계분석을 통하여 정밀성(precision) 및 반복성(repeatability) 평가를 위한 실험실간, 일간 평균 CV는 약 10%로 확인되었다. 특이성과 검출한계는 음성 대조액 대비 최저 농도 표준액의 흡광도 통계분석에서 10 IU/L 이하로 결정되었으며, 정량한계는 10~150 IU/L로 확인되었다. 표준곡선의 직선성은 본실험과 예비실험을 포함한 모든 결과에서 $R^2$>0.998로 우수하였으며, 완건성(Robustness)는 matrix effect등을 평가하기 위하여 사용된 3 개군 (사람면역글로불린, 말토즈첨가사람면역글로불린 pH4.2 및 B형간염 사람면역글로불린) 그리고 희석용액인 5% 사람혈청알부민을 이용하였을 때 회수율이 100.1%로 조사되었다. 동 연구결과 22개의 검체에 대한 조사에서 IMx 및 AxSYM 장비를 이용한 MEIA 결과와 ELISA 키트의 결과는 상관성을 나타내었다. 따라서 ELISA 키트를 이용한 국가검정이 현행 국가검정 시험법인 MEIA법을 대체 가능한 것으로 판단되었다. 특히 4개 실험실과 일간 변이결과 또한 CV~10% 이하로 조사되었으며, 면역글로불린 및 말토즈 첨가사람면역글로불린의 기준 (>0.19 IU/50 mg 면역글로불린)을 5배 이상 상회하는 범위에서 변이가 관찰되었다. 현재 제조사의 자사기준에 근거한 표준시험방법과 연구사업에서 사용한 표준시험방법은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았으나 표준곡선의 범위와 검체 희석배수를 조정하여 표준곡선의 중간점으로 검체 흡광도를 조정한 본 시험법이 보다 신뢰도 높은 결과값을 제시할 것으로 판단되어 동 표준시험방법의 제정할 예정이다. 이로써 본 연구를 통하여 B형간염 표면항원 항체가 시험법을 확립하였고 관련 면역글로불린제제의 품질관리 향상에 기여할 것으로 판단된다.

Abstract ▼

Comparison of 5 assay methods for anti-HBsAg is performed to improve potency assay of human immunoglogulinG (HuIgG) preparation. Current assay method based on microparticle enzyme immuno assay (MEIA) with IMx (Abott) has some disadvantage including discontinuation of related reagent and limited samp

Comparison of 5 assay methods for anti-HBsAg is performed to improve potency assay of human immunoglogulinG (HuIgG) preparation. Current assay method based on microparticle enzyme immuno assay (MEIA) with IMx (Abott) has some disadvantage including discontinuation of related reagent and limited sample number for one assay. Therefore, to overcome these issues, the purpose of this study was to establish ELISA method for anti-HBsAg comparing with current MEIA methods. First of all, three commercial ELISA kits were compared with co-laboratory studies including manufacturers and KFDA (total 1728 data) using national standard (NS) of and international standard (IS) of anti-HBsAg. Resulted similar reproducibility (average CV=5%, recovery>96%) of each kits however, Enzygnost(Abott) was selected as an optimal kit which showed the most stable precision (CV=4.1%) when the negative serum was applied as diluent for sample and standard. Even though, negative serum and 5% human serum albumin (HSA) showed compatible reproducibility, negative serum gave better precision (CV=4.1% vs 7.1%) and lower background (data not shown). Using optimal ELISA kit, the validation were performed including intra- and inter-day assay, inter-laboratory assay data and inter-method comparison with 22 representative HuIgG preparations (total 4312). The samples consists of 9 lot of maltose added HuIgG, 3 lot of HuIgG, 5 lot of Anti HBV HuIgG and 5 NS spiked samples (total 22 samples). As a result intra day precision was 4.6${\pm}$2.0% and inter day precision was 7.7${\pm}$5.3 for ELISA (N=180 for 5 days), 3.7${\pm}$1.9 for AxSym (N=10 for 5 days) and 1.6${\pm}$0.8 for IMx(N=6 for 2 days). With the result of NS 10 IU spiked samples (4 representative samples and 1 blank), the mean recovery% was 100.1${\pm}$12.55% (N=752). The statistical analysis showed the detection limit of ELISA was below 10 IU/L and the range was 5~150 IU/L. The linearity of dose response curve with NS were good ($R^2$>0.998) and robustness was proved based on the spiking assay with representative samples (100.1%) which showed no matrix effect. Therefore, the ELISA assay was validated and showed co-relation to MEIA including two automated instruments; IMx and AxSYM. As a conclusion the ELISA assay could replace current assay method, MEIA resulted from 22 sample comparison assays for 5 day-to-day data with 4 laboratories. We will provide standard operating procedure of anti-HBsAg assay with the ELISA as a validated assay which was expected to improve the quality control of related preparations.

목차 Contents

• 자체연구개발과제 최종보고서...1
• 표지...2
• 요약문...4
• Summary...5
• 목차...6
• I. 연구개발과제 연구결과...7
• 제1장 연구개발과제의 개요...7
• 제2장 연구개발과제의 국내ㆍ외 연구개발 현황...9
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과...10
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...49
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...50
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획...51
• 제7장 참고문헌...52
• 제8장 첨부서류...53