초록 ▼

1. 최종목표
본 기술과제의 최종목표는 우리나라 전통 발효식품인 청국장으로부터 혈전용해효소(나토키나제) 활성이 높은 미생물 균주를 분리하여 특성을 밝히고 이 균주를 이용하여 혈전용해능이 뛰어난 기능성 청국장을 제조하여 심혈관계 질환을 예방 및 치료를 위한 건강보조식품으로 개발하는 것이며 분리된 균 주로부터 혈전용해효소를 대량생산하는데 필요한 액체발효 기술을 확립하는 것이다.
2. 개발내용 및 결과
1) 혈전용해효소 활성이 높은 미생물의 분리 및 동정
전국에서 수집한 22종의 청국장 시료로부터 단백질분해능이 우수

1. 최종목표
본 기술과제의 최종목표는 우리나라 전통 발효식품인 청국장으로부터 혈전용해효소(나토키나제) 활성이 높은 미생물 균주를 분리하여 특성을 밝히고 이 균주를 이용하여 혈전용해능이 뛰어난 기능성 청국장을 제조하여 심혈관계 질환을 예방 및 치료를 위한 건강보조식품으로 개발하는 것이며 분리된 균 주로부터 혈전용해효소를 대량생산하는데 필요한 액체발효 기술을 확립하는 것이다.
2. 개발내용 및 결과
1) 혈전용해효소 활성이 높은 미생물의 분리 및 동정
전국에서 수집한 22종의 청국장 시료로부터 단백질분해능이 우수한 약 100여종의 균주를 1차 선별하고 이들 중 혈전용해활성이 높은 10종의 균주를 2차 선별하였다. 2차 선발된 균주들 중 혈전용해능이 뛰어난 6균주를 이용하여 청국장 분말을 제조하여 혈전용해 효소량을 fibrin plate방법을 이용하여 측정한 결과 가장 높은 활성을 보인 DGCK2를 최종 생산균주로 선정하였다. 최종 선발된 DGCK2를 동정하기 위하여 형태학적, 배양 및 생화학적 특성을 조사하였고 16S rDNA 염기서열을 이용한 분석 결과 Bacillus subtilis와 99% 상동성을 나타내어 본 균주를 Bacillus subtilis DGCK2로 명명하였다. Fibrin-zymography를 수행한 결과 DGCK2는 약 37 kDa 크기의 혈전용해효소를 생성하는 것으로 나타났다.
2) 액체배지에서의 혈전용해효소 생산을 위한 배지 최적화
배지종류에 따른 혈전용해효소의 생산성을 비교한 결과 tryptic soy broth(TSB) 배지에서 혈전용해 효소의 활성이 가장 높아 TSB 배지를 액체배양을 위한 기본배지로 사용하기로 결정하였다. 혈전용해효소의 생산을 더욱 증가시키기 위한 탄소원의 효과를 조사한 결과 0.6%의 soluble starch를 첨가하였을 때 가장 높은 효소활성을 나타냈다. 질소원으로는 0.4% soybean flour를 첨가 시에 효소활성이 가장 높았다. 효소 생산과 균체 증식에 있어서 미량원소로서 금속염의 영향을 조사한 결과 MgCl2를 첨가 시 효소생산이 가장 높게 나타났다. 배지의 초기 pH와 배양온도가 효소생산에 미치는 영향을 조사한 결과 pH 6.0에서 가장 큰 생산을 보였으며 pH 5.5∼7.5에서도 비교적 안정적인 효소생산을 보였다. 배양 온도는 35℃에서 배양 시 효소활성이 가장 높게 나타났다.
3. 사업성과
○기술적 성과
1) 기존의 마이코 생산균주보다 혈전용해 활성이 2.5배 더 높은 균주(DGCK2)를 청국장으로부터 분리하였고 동정 결과 Bacillus subtilis 종으로 판명되어 이 균주를 Bacillus subtilis DGCK2로 명명하였다.
2) 액체배지에서 혈전용해효소를 대량생산하기 위한 최적의 배지조성 및 배양조건을 확립하였다.
○ 경제적 성과
1) 혈전용해효소 활성을 강화한 기능성 청국장을 종전과 동일한 제법과 비용으로 생산할 수 있어 부가가치를 높이고, 소비자는 저렴한 비용으로 기능성 청국장을 구입할 수 있어 경제적으로 이익임.
2) 수입에 의존하는 기존의 나토키나제 제품이나 혈전용해제를 대체함으로서 수입대체의 효과를 나타냄.
3) 혈전용해효소의 생산을 극대화할 수 있는 최적의 배양조건을 확립함으로서 생산비용을 줄일 수 있고 대량생산이 가능하게 됨.
○ 사회적 성과
1) 고령화 사회로 접어듦에 따라 순환계질병 환자의 증가로 인한 사회문제가 심각할 것으로 보임. 혈전용해효소 활성이 강화된 청국장을 항시 섭취함으로써 순환계 질병을 예방할 수 있으며 국민건강 향상에 기여할 것으로 보임.
2) 혈전용해효소 활성이 강화된 기능성청국장은 의약품이 아니기 때문에 의사 처방이 필요 없어 구입과 복용이 편리함.
3) 혈전으로 인한 질병을 예방함으로서 행복한 가정생활을 영위할 수 있음.
4. 향후추진계획
1) 본 과제에서 분리된 혈전용해효소 생산균주 DGCK2의 유전체로부터 혈전용해효소 유전자를 클로닝하여 대장균에 도입, 발현시켜 유전공학적인 방법으로 혈전용해효소를 대량 생산하고자 한다.
2) 본 기술개발연구에서 분리된 균주를 이용한 기능성 청국장에 다른 건강식품원료를 첨가하여 새로운 건강보조제를 생산하고자 함.
3) 본 과제에서 확립된 액체발효 기술을 혈전용해효소의 정제에 필요한 조효소를 준비하는데 이용하여 심혈관계 질환의 예방 및 치료를 위한 새로운 혈전용해제를 개발하는데 활용하고자 함.

목차 Contents

• 개발결과의견서 ...1
• 최종보고요약서(초록) ...3
• 목 차 ...5
• 제 1 장 서론 ...7
• 제 1 절 기술개발과제의 개요 ...7
• 제 2 절 기술개발의 목적 및 필요성 ...8
• 1. 기술개발의 목적 ...8
• 2. 기술개발의 필요성 ...9
• 3. 기존 혈전용해제의 문제점 ...10
• 제 3 절 국내.외 기술개발 현황 ...11
• 1. 혈전용해제의 현황 ...11
• 2. 국외 현황 ...11
• 3. 국내 현황 ...12
• 제 2 장 과제개발 내용 및 방법 ...12
• 제 1 절 혈전용해효소 활성이 높은 미생물의 분리 및 동정 ...12
• 1. 배지 ...12
• 2. 미생물의 분리 및 선정 ...12
• 3. Fibrin plate의 제조 및 혈전용해효소 활성 측정 ...13
• 4. 분리균을 이용한 청국장 분말의 제조 및 효소활성 측정 ...13
• 5. SDS-PAGE와 Fibrin-Zymography ...13
• 6. 미생물의 동정 ...13
• 제 2 절 액체배지에서의 혈전용해효소 생산을 위한 배지 최적화 ...14
• 1. 액체발효를 위한 기본배지의 선정 ...14
• 2. 효소생산을 위한 배지의 최적화 ...14
• 3. 효소생산을 위한 pH 및 온도 결정 ...14
• 제 3 장 사업성과 ...15
• 제 1 절 기술적 성과 ...15
• 1. 혈전용해효소 활성이 높은 미생물의 분리 및 동정 ...15
• 1) 균주의 분리 및 선발 ...15
• 2) 청국장 제조에 의한 효소의 생성 ...15
• 3) 분리균주의 동정 ...15
• 4) Fibrin-zymography를 이용한 혈전용해효소 분석 ...16
• 2. 액체배지에서의 혈전용해효소 생산을 위한 배지 최적화 ...24
• 1) 배지종류에 따른 혈전용해효소의 생산성 ...24
• 2) 탄소원의 영향 ...24
• 3) 질소원의 영향 ...24
• 4) 금속염의 영향 ...24
• 5) 초기 pH의 영향 ...25
• 6) 효소생산에 미치는 배양온도의 영향 ...25
• 제 2 절 경제.산업적 성과 ...31
• 제 3 절 사회.문화적 성과 ...31
• 제 4 장 결론 ...31
• 제 1 절 목표 달성도 ...31
• 1. 혈전용해능이 강화된 기능성 청국장의 제조 ...31
• 2. 혈전용해효소(나토키나제) 생산을 위한 액체발효 기술개발 ...32
• 제 2 절 관련분야의 기여도 및 기대효과 ...33
• 1. 관련분야의 기여도 ...33
• 1) 기술적 측면에서의 기여 ...33
• 2) 경제.산업적 측면에서의 기여 ...33
• 3) 사회.문화적 측면에서의 기여 ...33
• 2. 제품화 시 예상되는 기대효과 ...33
• 1) 기술적 측면 ...33
• 2) 경제.산업적 측면 ...34
• 제 3 절 기술개발결과의 활용계획 ...34
• 제 5 장 참고문헌 ...35