초록 ▼

○ 세균성(ETEC K88ac & 987P, Salmonella) 자돈 설사병 방지효과를 확인한 당근백신의 선행연구를 기초로 발현 및 축적 양을 증가시킨 다중복합 식물경구백신 우량 세포주를 선발 및 관리하여 산업체 요구 규모의 생산을 지원함.
○ 신생자돈의 설사를 일으키는 바이러스성 병원균인 Rotavirus와 PEDV의 항원유전자를 크로닝하여 고효율의 식물백신을 새롭게 개발함.
○ 본 연구에서 대상으로 하는 병원체의 항원 및 항체의 정량분석체계를 확립함.
○ 경구백신 유식물체의 배양조건을 최적화하여 대규모

○ 세균성(ETEC K88ac & 987P, Salmonella) 자돈 설사병 방지효과를 확인한 당근백신의 선행연구를 기초로 발현 및 축적 양을 증가시킨 다중복합 식물경구백신 우량 세포주를 선발 및 관리하여 산업체 요구 규모의 생산을 지원함.
○ 신생자돈의 설사를 일으키는 바이러스성 병원균인 Rotavirus와 PEDV의 항원유전자를 크로닝하여 고효율의 식물백신을 새롭게 개발함.
○ 본 연구에서 대상으로 하는 병원체의 항원 및 항체의 정량분석체계를 확립함.
○ 경구백신 유식물체의 배양조건을 최적화하여 대규모 체세포배 유도를 통한 식물백신의 기내 대량생산체계를 구축하고， 기술이전을 위한 경제성 분석을 수행함.
○ 생산된 백신 유식물체의 동결건조 등을 통해 저장성， 사용편리성의 증가된 분말/액상 사료첨가제로 가공하고， 가공 및 저장에 따른 면역유도효율을 검사하여 최적의 사료첨가제용 식물백신 시제품 생산공정을 확립함.
○ 형질전환 백신당근 유식물의 모돈 경구투여에 의한 자돈 설사병 방제법을 산업현장에서 시험하여 개발함.

Abstract ▼

In an attempt to develop the oral vaccine against the diarrhea-inducing pathogens in piglets, the antigen genes were isolated and re-constructed for plant transformation and expression. Selection was completed among the ETEC vaccine carrot cell lines established from the previous research in terms o

In an attempt to develop the oral vaccine against the diarrhea-inducing pathogens in piglets, the antigen genes were isolated and re-constructed for plant transformation and expression. Selection was completed among the ETEC vaccine carrot cell lines established from the previous research in terms of expression levels of the antigen and performance of tissue culture. NspCTJ11-1 line showed 102 <TEX>$\mu$</TEX>g/g TSP of K88ac pillin antigen and used for mass production and animal test. Depending on the types of the cell and embryos in culture as well as batches, amounts of the antigen expressed were increased upto 188 <TEX>$\mu$</TEX>/ g TSP. Besides PEDV and Rota virus vaccine were designed as various types such as single antigen, double antigens, and triple antigens using different parts of the antigens. Among them the ultimate constructs are PER05CT and PER08CT, including PEDV, Rotavirus, and CT-B as adjuvants.
The mass production system of transgenic carrot callus was established with an aIm for industrial scale bioreactor culture. The effects of various kinds and concentration of plant growth regulator (2, 4-D, IBA, NAA, BA, kinetin and 2-ip), sucrose concentration, seed concentration and aeration were examined. The combined treatment of PGR, production of transgenic carrot callus was highest in MS liquid medium with 1.0 mg/L BA and 0.1 mg/L BA and the effect by sucrose concentration (1, 3, 7%) was highest in MS liquid medium with 3% sucrose. In air-lift bioreactor culture, maximum production ratio (9 times higher at max) of transgenic carrot callus was obtained in 0.1% seed concentration and that shows favorable result on aeration of 300 cc/min. These results indicate that the production of transgenic carrot callus (oral vaccine) to protect against diarrhea of piglets can be applied to large scale culture for practical application.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 11
• 목차 ... 12
• 제1장 서 론 ... 16
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 17
• 제1절 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus) ... 17
• 제2절 로타바이러스 (Porcine group A rotavirus) ... 17
• 제3절 식물경구백신 ... 18
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
• 제1절 형질전환 백신당근 세포주 개발과 기능성 사료첨가제산업화 ... 20
• 1. 서 언 ... 20
• 2. 재료 및 방법 ... 22
• 가. 돼지 바이러스성 설사 예방 백신 벡터 구축 및 당근 형질전환 ... 22
• (1) 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원유전자의 클로닝 ... 22
• (2) 로타바이러스 항원 유전자 합성 및 클로닝 ... 23
• (3) 돼지 유행성 설사병 바이러스와 로타바이러스 융합 항원유전자의 클로닝 ... 26
• (4) 점막면역보조제 융합 항원유전자의 클로닝 ... 27
• (5) 식물형질전환용 벡터 구축 및 Agrobacteria 형질전환 ... 31
• (6) Agrobacteria를 이용한 당근 형질전환 및 세포주 선발 ... 32
• 나. 대장균에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원 단백질 및 항체 생산 ... 33
• (1) 항원단백질 발현 벡터 구축 ... 33
• (2) 항원단백질 발현 및 분리 ... 33
• (3) 다클론 항체 생산 ... 33
• 다. 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원유전자 당근 형질전환체 분석 ... 33
• (1) 당근 캘러스 genornic DNA 추출 ... 33
• (2) 당근 캘러스 RNA 추출과 RT-PCR ... 34
• (3) 식물 단백질 추출 및 westem 분석 ... 34
• 3. 결과 및 고찰 ... 35
• 가. 당근 형질전환체의 개발 ... 35
• (1) 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원 유전자의 확인 ... 35
• (2) 로타바이러스 항원 유전자의 확인 ... 37
• (3) 돼지 유행성 설사병과 로타바이러스 융합 항원 유전자의 확인 ... 40
• (4) 점막면역보조제 융합 항원 유전자의 확인 ... 41
• (5) 당근형질전환 벡터를 이용한 Agrobacteria 형질전환 ... 44
• (6) 당근 형질전환체 세포주 선발 ... 49
• 나. 대장균에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 로타바이러스 항원 단백질 항체생산 ... 50
• (1) 항원 단백질 발현 벡터 확인 ... 50
• (2) 항원 단백질 발현 및 항체 생성 확인 ... 52
• 다. 당근 형질전환체 분석 및 계통 선발 ... 53
• (1) 당근 캘러스의 genomic DNA PCR 분석 ... 53
• (2) 당근 캘러스의 RT-PCR 분석 ... 55
• (3) 당근 캘러스의 선발 및 westem 분석 ... 57
• 4. 적요 ... 63
• 가. 박테리아성 설사병 유발 ETEC K88의 형질전환 당근백신의 효능 ... 63
• 나. 바이러스성 설사병 유발 PEDV의 형질전환 당근백신 ... 63
• 다. Rotavirus 단일항원의 우량세포주 선발 ... 63
• 라. PEDV와 Rotavirus 융합 백신당근 개발 및 생산 ... 63
• 제2절 형질전환 백신당근 유식물의 기내 대량생산체계 확립 및 가공공정 개발 ... 64
• 1. 서 언 ... 64
• 2. 재료 및 방법 ... 65
• 가. 형질전환 당근 캘러스 line ... 65
• 나. 형질전환 당근 캘러스의 배양 조건 ... 65
• 다. 형질전환 당근 캘러스의 현탁 배양 조건 ... 65
• 라. 형질전환 당근 캘러스의 생물반응기 배양 조건 ... 66
• 마. 결과 조사 ... 66
• 바. 식물 단백질 추출 및 westem 분석 ... 66
• 3. 결과 및 고찰 ... 67
• 가. 최적 배양 온도 결정 ... 67
• 나. 최적 배양일(생장패턴) ... 68
• 다. 에너지원(sucrose) 농도 ... 68
• 라. 식물 생장 조절 물질의 종류 및 농도 ... 69
• 마. Seed의 배양일 ... 70
• 바. 생물반응기 내의 시료 접종 농도 ... 71
• 사. 생물반응기 내의 공기 공급량 ... 71
• 아. 배양배지의 공급 ... 72
• 자. 산업화 규모의 식물 경구백신 생산 ... 73
• 차. 형질전환 당근 조직 배양체의 항원 단백질 저장성 조사 ... 73
• 카. 경제적/실용적 제형의 시제품 제작 ... 74
• 타. 대량생산 경제성 분석 ... 75
• 파. 생산시료 현황 ... 75
• 4. 적요 ... 76
• 제3절 형질전환 백신당근 유식물의 모돈 경구투여에 의한 자돈 설사병 방제법 개발 ... 77
• 1. 서언 ... 77
• 2. 재료 및 방법 ... 80
• 가. Mouse에서 ETEC K88ac와 PEDV의 면역능 확인 실험 ... 80
• (1) 시험동물 및 시험설계 ... 80
• (2) ELISA와 통계 분석 ... 80
• 나. ETEC K88ac의 유즙면역을 통한 자돈 설사 방제효과 ... 81
• (1) 시험동물 및 시험설계 ... 81
• (2) 설사지수 ... 81
• (3) 육안검사 ... 82
• (4) 병리조직학적 분석 ... 82
• (5) 점액세포수 분석 ... 82
• (6) 면역조직화학적 분석 ... 83
• (7) 항체 역가검사 ... 84
• (8) 대장균 검출 ... 85
• (9) 통계 분석 83 ... 85
• 나. PEDV의 자돈설사 방제효과 확인 ... 85
• (1) 설사지수 ... 86
• (2) RT-PCR에 의한 PEDV 검출 ... 86
• (3) 병리조직학적 분석 ... 87
• (4) 항체역가검사 ... 87
• (5) 통계 분석 ... 88
• 다. PEDV의 베트남 양돈장에서 자돈 면역능 확인 시험 ... 88
• 라. PEDV의 베트남 양돈장에서 유증을 통한 자돈 면역능 확인 실험 ... 88
• 3. 결과 및 고찰 ... 89
• 가. Mouse에서 ETEC K88ac와 PDEV의 면역능 확인 실험 ... 89
• 나. ETEC K88ac의 유즙면역을 통한 자돈 설사 방제효과 ... 90
• (1) 체중변화와 설사지수 ... 90
• (2) 육안검사 ... 91
• (3) 병리조직학적 분석 ... 92
• (4) 점액세포수 분석 ... 94
• (5) 면역조직화학적 분석 ... 95
• (6) 항체역가검사 ... 96
• (7) 대장균 검출 ... 98
• (8) 고찰 ... 99
• 다. PEDV의 자돈설사 방제효과 확인 ... 101
• (1) 증체량 ... 101
• (2) 체온 ... 101
• (3) 설사지수 ... 102
• (4) PCR을 이용한 분변에서의 PED 바이러스의 검출 ... 102
• (5) 병리조직학적 분석 ... 103
• (6) 항체 역가검사 ... 104
• (7) 육안검사 ... 104
• (8) 고찰 ... 104
• 라. PEDV의 베트남 양돈장에서 자돈 면역능 확인 시험 ... 108
• 마. PEDV의 베트남 양돈장에서 유증을 통한 자돈 면역능 확인 실험 ... 108
• 4. 적요 ... 109
• 가. Mouse에서 ETEC K88ac와 PEDV의 면역능 확인 실험 ... 109
• 나. ETEC K88ac의 유즙면역을 통한 자돈 설사 방제효과 ... 109
• 다. PEDV의 자돈설사 방제효과 확인 ... 109
• 라. PEDV의 베트남 양돈장에서 자돈 면역능 확인 시험 ... 110
• 마. PEDV의 베트남 양돈장에서 유증을 통한 자돈 면역능 확인 실험 ... 110
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 111
• 제1절 목표대비 달성도 ... 111
• 제2절 정량석 성과(논문게재, 특허출원, 기타) ... 113
• 1. 전문학술지 논문 게재 ... 113
• 2. 학술발표 ... 114
• 3. 특허 출원/등록 ... 116
• 4. 기술이전 ... 116
• 5. 기 타 ... 116
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 117
• 1. 베트남에 진출 중인 국내 기업과의 가능성 타진 ... 117
• 2. CTCBio Vietnam Co., LTD와 양해 각서 체결 ... 118
• 3. 개발된 최적 농도 및 투여 방법에 대한 기술이전 모색 ... 118
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 119
• 제7장 기타 중요 변동사항 ... 120
• 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비현황 ... 120
• 제9장 참고문헌 ... 121
• 끝페이지 ... 134