초록 ▼

조류인플루엔자 바이러스에 대한 예방, 증식억제 감염 조기 식별 시스템을 구축하고자 하였으며, 연구 진행의 효율성을 위하여 저병원성 조류인플루엔자 H9N2(A/Ck/kr/MS96/96) 바이러스 (폐사율 75% 이하)를 모델시스템으로 사용하여, 저병원성 조류독감 제어 모델을 개발하여 장차 고병원성에 적용될 수 있도록 하고자 하였다.
본 연구는 3개의 세부과제로 되어 있으며, 세부과제별 연구내용은 다음과 같다.
1. 제1세부과제: 조류독감 감염 조기 식별 리포터 및 바이러스 증식 억제 세포내 항체 발현 시스템 개발
제1

조류인플루엔자 바이러스에 대한 예방, 증식억제 감염 조기 식별 시스템을 구축하고자 하였으며, 연구 진행의 효율성을 위하여 저병원성 조류인플루엔자 H9N2(A/Ck/kr/MS96/96) 바이러스 (폐사율 75% 이하)를 모델시스템으로 사용하여, 저병원성 조류독감 제어 모델을 개발하여 장차 고병원성에 적용될 수 있도록 하고자 하였다.
본 연구는 3개의 세부과제로 되어 있으며, 세부과제별 연구내용은 다음과 같다.
1. 제1세부과제: 조류독감 감염 조기 식별 리포터 및 바이러스 증식 억제 세포내 항체 발현 시스템 개발
제1세부과제의 연구내용은 다음과 같이 세 가지로 되어 있다.
가. 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발현 증가를 보이는 유전자인 FK506-binding protein 51 (FKBP51) 유전자의 promoter를 이용한 감염 특이적 발현에 관한 연구로서, FKBP promoter에 감염특이적 발현을 유도하는 glucocorticoid response element (GRE) 를 포함하는 enhancer 부위(닭의 FKBP51 유전자의 intron 5에 위치)를 결합한 promoter를 만들어 glucocorticoid(dexamethasone)에 대한 반응성을 조사하고, 여기에 추가적으로 interferon response element (IRE)와 NF$\kappa$B response element (NRE)를 첨가한 promoter의 활성을 dexamethasone, interferon, lipopolysaccharide 처리하에서 연구한다.
나. 닭에 사용될 수 있는 적절한 리포터 유전자를 찾기 위해 닭의 배설물에 자연상태로 존재하는 luciferase와 분비성 luciferase, alka1ine phosphatase 활성을 조사한다. 또한 FKBP51 promoter에 green fluorescence protein (GFP)을 연결하고 dexamethasone에 의한 발현 유도를 확인한다.
다. 조류인플루엔자 바이러스의 여섯 가지 내부 단백질(PA, PBl, PB2, NP, M, NS)에 대한 세포내항체 (단일사슬항체, single chain variable fragment, scFv)를 단일사슬항체 library (phage display library 및 yeast two-hybrid library)로부터 screemng하고, screemng 된 단일사슬항체의 바이러스 억제능력을 배양세포를 이용하여 전사 수준 및 바이러스 입자 생성 수준에서 조사하여 우수한 단일사슬항체를 선별한다.
2. 제1협동과제: 플라비바이러스 역상유전자시스템을 이용한 동물용 재조합 조류독감 바이러스 백신 후보물질 작성 및 특성 분석에 관한 연구
제1협동과제에서는 플라비바이러스 역상유전자시스템 (reverse genetics system)을 이용하여, 조류인플루엔자 예방을 위한 새로운 개념의 차세대 조류인플루엔자바이러스 예방백신 후보물질의 개발 및 특성을 분석하고자 하며 다음과 같은 연구 내용을 포함하고 있다.
가. 플라비바이러스인 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV) 백신주의 genome RNA로부터 full length cDNA를 합성하고, 이 cDNA에, 조류인플루엔자 바이러스의 표면항원인 Hemagglutinin(HA) 및 Neuraminidase (NA) 유전자를 삽입하여 이 두 표면항원을 발현하는 재조합 JEV 바이러스를 합성한다.
나. 재조합 JEV virus에서 발현하는 HA 및 NA 단백질을 확인하기 위하여 조류인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA에 특이적으로 반응하는 다클론항체 생산한다.
다. JEV virus 의 구조단백질 prM과 E를 발현하는 stable packaging cell line을 개발하고 이 packaging cell line을 이용하여 prM과 E 유전자가 결손되고 조류인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 유전자를 발현하는 JEV viral replicon particles을 생산한다.
라. Mouse 동물 모델시스템을 이용하여, 조류인플루엔자바이러스의 HA 및 NA 유전자를 발현하는 재조합 JEV 바이러스 또는 JEV viral replicon particles의 병원성과 면역원성을 분석하고, 분자생물학적 특성을 규명한다.
3. 제2협동과제: 조류독감 감염 조기 식별 리포터 및 조류독감 증식 억제 세포내 항체 발현 형질전환 닭의 생산
제2협동과제에서는 제1세부과제에서 개발한 감염특이적 발현을 하는 FKBP51 유전자의 promoter를 활용하여 GFP와 세포내항체 (scFv)를 감염특이적으로 발현하는 형질 전환 닭을 생산하고자 하며 다음과 같은 연구 내용을 포함하고 있다.
가. 배반엽단계(stage-X) 수정란을 대리난각 배양법으로 체외 배양하고 부화율을 조사하여 체외배양법을 확립한다.
나. FKBP51 유전자 promoter 하에서 GFP 혹은 세포내항체(scFv)를 발현할 수 있는 lentivirus vector를 제작하고 packaging cell line(293FT)에 transfection 하여 lentivirus를 생산한다.
다. 재조합 lentivirus를 배반엽단계 수정란에 주입하고 대리난각에 배양하여 모자이크 형질전환체(G0 세대)를 부화시킨다. 부화된 병아리의 혈액 DNA를 주형으로 PCR에 의해 형질전환체(G0)를 확인하고 사양한다. 이들 중 정액 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 germ line transmission이 가능한 개체를 선별한다. GO 세대를 교배하여 G1 세대(heterozygote)를 PCR 에 의해 선별하고 계통을 유지한다.
라. 형질전환체(heterozygote)의 특성 을 분석 한다. GFP 발현 형질전환체는 dexamethasone을 주사한 후 GFP의 발현 양상을 시간별로관찰 한다. 또한 조류인플루엔자 H9N2를 감염하여 동일한 방법으로 GFP의 발현 변화를 관찰한다. 필요한 조직에서의 GFP발현을 형광 현미경으로 관찰한다.

Abstract ▼

Recently, avian influenza virus (AIV) became not only a cause of economic loss in poultry industry worldwide but also a potential source for pandemic human infection. Because of its variety of subtypes as well as frequent occurrence of variant mutant strains within a subtype, the prevention of infec

Recently, avian influenza virus (AIV) became not only a cause of economic loss in poultry industry worldwide but also a potential source for pandemic human infection. Because of its variety of subtypes as well as frequent occurrence of variant mutant strains within a subtype, the prevention of infection by conventional vaccine has not been effective and other effective ways of control are required.
The goal of this study is to find and evaluate more effective ways of AIV control. The tilte of the project is 'Development of virological and immunological control systems of avian influenza virus'. The project is composed of three sub-projects; the first sub-project, the first collaborative project and the second collaborative project. The outline of research plan and the results for each of the three sub-projects are as follows.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 13
• CONTENTS ... 17
• 목차 ... 19
• 제1장. 서 론 ... 21
• 1. 필요성 ... 21
• 2. 연구목표 ... 21
• 제2장. 국내외 기술개발 현황 ... 22
• 제3장. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 24
• 1. 제1세부: 조류독감 감염 조기 식별 리포터 및 바이러스 증식 억제 세포내 항체 발현시스템 개발 ... 24
• 2. 제1협동: 플라비바이러스 역상유전자시스템을 이용한 동물용 재조합 조류독감바이러스 백신 후보물질 작성 및 특성 분석에 관한 연구 ... 40
• 3. 제2협동과제: 조류독감 감염 조기 식별 리포터 및 조류독감 내성 세포내 항체 형질전환 닭의 생산 ... 56
• 제4장. 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 66
• 1절. 목표대비 달성도 ... 66
• 2절. 정량적 성과 ... 67
• 제5장. 연구개발결과의 활용계획 ... 73
• 1. 특허출원 ... 73
• 2. 역상유전자 시스템을 이용한 재조합 백신 제조 ... 73
• 3. EGFP 발현 형질전환 닭의 활용 가능성 ... 73
• 제6장. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 74
• 제7장. 기타 중요 변동사항 ... 75
• 제8장. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 76
• 제9장. 참고문헌 ... 77
• 끝페이지 ... 78