초록 ▼

- 전통 발효 식품 및 건강한 사람, 다양한 가축의 배설물을 포함한 생물자원 확보
ㆍ 프로바이오틱 균주의 보고로 알려진 김치, 청국장, 젓갈 등 전통 발효 식품을 지역별, 재료별, 숙성도에 따라 다양하게 확보함.
ㆍ 사람 및 가축의 장내세균은 생체의 건강 상태와 매우 밀접한 상관관계가 있다는 점에 착안하여 건강한 장내 상태를 유지하는 장내세균의 우점종이 포함된 분변을 다량으로 확보함.
-？프로바이오틱 균주 선별을 위한 top agar plate/colorimetric assay 기법 개발 및 이용
ㆍ 병원성 미

- 전통 발효 식품 및 건강한 사람, 다양한 가축의 배설물을 포함한 생물자원 확보
ㆍ 프로바이오틱 균주의 보고로 알려진 김치, 청국장, 젓갈 등 전통 발효 식품을 지역별, 재료별, 숙성도에 따라 다양하게 확보함.
ㆍ 사람 및 가축의 장내세균은 생체의 건강 상태와 매우 밀접한 상관관계가 있다는 점에 착안하여 건강한 장내 상태를 유지하는 장내세균의 우점종이 포함된 분변을 다량으로 확보함.
-？프로바이오틱 균주 선별을 위한 top agar plate/colorimetric assay 기법 개발 및 이용
ㆍ 병원성 미생물이 포함된 top agar plate 위에 전통 발효식품, 사람 및 가축의 분변 등 이미 확보된 생물자원 샘플을 적당한 비율로 희석하여 도말한 후 1-2일 동안 배양함. 각각의 병원성 균주에 대해 항균활성 정도를 clear zone 크기로 확인한 후 1차 프로바이오틱 균주 후보로 선발함. 1차 프로바이오틱 균주를 포함하고 있는 top agar plate 위에 셀룰로오스 멤브레인을 조심스럽게 올려놓은 후 이미 준비된 푸른색의 색깔 반응 시료를 분사하여 실온에서 30-60분 동안 방치하면서 색깔 변화를 관찰함. 일반적으로, 항균 펩타이드는 세포막의 phospholipid에 작용하여 항균활성을 나타내기 때문에 1차적으로 스크리닝된 프로바이오틱 균주 후보들 중 항균 펩타이드를 생산하는 균주의 경우 콜로니 주위가 푸른색에서 붉은색으로 변화된 것을 확인할 수 있으며, 이들 균주를 항균 펩타이드 생산 최종 프로바이오틱 균주로 선발함.
- 다양한 인지질(phospholipid)의 나노 입자 표면 고정화를 통한 미생물 세포막 모사체 개발
ㆍ 그람 양성, 그람 음성 세균, 진균 각각에 특이적인 세포막 구성 인지질의 비율에 따라 다양한 종류의 인지질을 혼합해 미생물 세포막을 최대한 모사하고, 이에 대한 결합 친화력이 있는 항균 펩타이드를 효율적으로 스크리닝할 수 있는 기반을 마련함.
ㆍ 미생물 세포막을 구성하는 인지질 혼합물을 최대한 실제 세포막과 비슷한 조건으로 제조하기 위해 인지질의 소수성 부분을 고정화하고 친수성 부분이 외곽으로 노출되도록 하는 방향성 있는 고정화 방법을 확립함.
ㆍ 수백 nm~수 μm 크기의 나노 입자 표면에 인지질 혼합물을 고정화하여 항균 펩타이드가 실제 미생물의 세포막에 작용하는 것과 유사한 결합 환경을 만듦, 스크리닝된 항균 펩타이드가 실제 미생물의 세포막에 활성을 나타낼 수 있는 가능성을 높이고자 함.
- 항균 펩타이드 생산 프로바이오틱 균주로부터 분비 펩타이드 혼합물 제조
ㆍ Top agar plate/colorimetric assay 기법에 의해 최종적으로 스크리닝된 항균 펩타이드 생산 프로바이오틱 균주의 배양액으로부터 항균 펩타이드를 포함하는 미생물 분비 펩타이드 혼합액을 추출, 농축하여 친화력 포획 실험에 이용함.
- 미생물 세포막 모사체 고정화 나노 입자를 이용한 항균 펩타이드 친화력 포획 및 항균 활성 검증
ㆍ 혼합 인지질로 이루어진 세포막 모사체를 고정화한 나노 입자를 미생물 분비 펩타이드 혼합액과 결합 반응시켜 세포막 모사체에 친화력이 있는 펩타이드, 즉 잠재적 항균 펩타이드를 포획함.
ㆍ 항균 펩타이드(nisin)을 생산하는 균주로 잘 알려진 모델 균주 Lactobacillus lactis ATCC 11454의 배양액을 유기 용매 추출, 농축 단계를 거친 다음 나노 입자에 고정화된 세포막 모사체에 적용함. 포획된 펩타이드를 나노 입자로부터 용출하고 타겟 미생물 Staphylococcus aureus에 대한 항균 활성을 액체 크로마토그래피-질량분석 (LC-MS) 및 2D-펩타이드 프로파일링을 이용해 정성/정량 분석함, 본 연구과제의 가능성을 확인함.
-？항균 펩타이드 생산 프로바이오틱 균주로부터 질량분석 기술과 펩티도믹스(peptidomics)를 이용한 항균 펩타이드의 고속 스크리닝
ㆍ 항균 활성이 검증된 세포막 모사체 결합 친화력 항균 펩타이드를 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS) 기술로 동정하여 용출 시간과 분자량에 기초한 2차원/3차원 펩타이드 프로파일을 작성함.
ㆍ 2차원/3차원 펩타이드 프로파일 상호간의 비교를 통해 인지질이 없는 나노 입자에 포획된 비특이적 결합 펩타이드는 제거하고 인지질에 특이적인 펩타이드들의 MS/MS 스펙트럼으로부터 아미노산 서열 정보를 획득.
ㆍ 아미노산 서열 정보는 기존에 보고된 미생물 프로테옴 데이터베이스와 비교, 혹은 denovo sequencing한 후 획득한 서열 정보들은 데이터베이스화함.
-？프로바이오틱 균주 및 항균 펩타이드의 특성 연구
ㆍ 프로바이오틱 균주의 내산성, 내담즙성 활력 시험 및 상피세포 접착 능력을 조사함.
ㆍ 항균 펩타이드의 아미노산 서열 및 구조 분석.
ㆍ 프로바이오틱 균주에 의해 생산된 항균 펩타이드의 다양한 스펙트럼 조사 및 안전성 독성시험을 실시함.
-？항생제 대체 항균 펩타이드성 바이오제재의 실용화 연구
ㆍ 발효조를 이용한 프로바이오틱 균주의 배양 조건을 확립하여 항균 펩타이드의 대량 생산을 가속화함.
ㆍ 획득된 항균 펩타이드의 아미노산 서열 치환에 의한 항균활성 배가, 2 종류의 항균 펩타이드 융합에 의한 항균 스펙트럼 및 항균활성 증대.
ㆍ 항균 펩타이드의 제제화에 따른 항균활성 유지 및 보존제 연구.
ㆍ 제품의 상온에서의 장기 보존성 및 극한 조건 (고온, 강산성, 강염기성)에서의 항균활성 유지 분석.
ㆍ 항균 펩타이드의 제품화시 포장방법에 따른 항균활성 및 품질 변화 분석

Abstract ▼

- Experimental resources
ㆍ A number of traditional fermented foods such as kimchi.
ㆍ Fecal samples containing predominant enterobacteria from healthy human beings and animals.
-？Development of top agar plate/colorimetric assay method for probiotics screening
ㆍ Antagonistic bacterial stra

- Experimental resources
ㆍ A number of traditional fermented foods such as kimchi.
ㆍ Fecal samples containing predominant enterobacteria from healthy human beings and animals.
-？Development of top agar plate/colorimetric assay method for probiotics screening
ㆍ Antagonistic bacterial strains were selected from various samples by using top agar plates containing clinical pathogens.
ㆍ The probiotics candidates were selected by the observation of clear zone.
ㆍ The probiotics producing antimicrobial peptide were finally obtained by using top agar plate combined with colorimetric assay.
ㆍ The cell-free supernatant containing antimicrobial peptide showed color change blue to red color.
- Immobilization of phospholipid on magnetic nanoparticle
ㆍ 10 mg of MPs were transferred into a 5 ml-volume screw-capped glass vial and vigorously washed three times with 1 ml of chloroform, then resuspended in chloroform solution (1 ml) containing 5 mg of DPPG and 1.2 mg of DPPE (4:1 of molar ratio)for making Gram-positive bacterial membrane-mimicking MPs.
ㆍ To mimic the membrane of Gram-negative bacteria, 1.3 mg of DPPG and 5 mg of DPPE (1:4 of molar ratio)were used. The MPs/PL mixtures were gently shaken under UV light (360nm) for 1h. After removing the floating PL, the PL-immobilized MPs (PL-MPs) were washed vigorously three times with 1ml of chloroform. The MPs were resuspended in 1ml of fresh chloroform and used.
ㆍ To confirm successful immobilization of primary amine group-containing lipids such as DPPE, ninhydrin assay was used after immobilization procedure. For quantification of saturated amounts of PL on MPs, 0.1, 0.5, 1,2 and 5 mg/ml of PE-CF were immobilized on MPs. Confocal microscopy (LSM5 Pascal; CarlZeiss, Jena, Germany) was used to obtain the fluorescent images of PE-CF-immobilized MPs. The fluorescent intensities were calculated with average values in three different positions using image analysis software.
- Capturing antimicrobial peptides with phospholipid-immobilized MPs
ㆍ The peptide pool secreted from hominicin-producing Staphylococcus hominis MBBL 2-9 was prepared and applied to ILAC method for the proof of concept.
ㆍ 5 mg of PG:PE (4:1)-immobilized MPs (GE-MPs) were used to capture hominicin from the complex peptide mixture.
ㆍ To discriminate the peptides non-specifically bound to the C6-moiety and the surface of MPs, the bare MPs (no PL immobilized) were used as a control. After removing chloroform from MPs-suspended solution, MPs were resuspended immediately in 50ml of DMSO. 350 ml of filtrated phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) was mixed with the DMSO solution containing MPs, and then 100 ml of peptide solution was added. The mixture solution was gently shaken in the dark for 1 h. To remove the peptides unbound or non-specifically bound onto the surface of MPs, the MPs were vigorously washed three times with PBS containing 10% DMSO. The peptides bound on lipid-immobilized MPs were eluted with 300 mL of water/ acetonitrile/ formic acid (49:50:1 (v:v:v), pH 2.0) by vigorous vortex and collected into a fresh tube. 300 ml of acetonitrile/formic acid (99:1 (v:v), pH 2.0) was used for the second elution of remaining peptides from MPs and added into the first eluted solution. The eluted peptide solutions were completely dried u ing a vacuum centrifuge (Ecospin 3180C; Hanil R&D, Seoul,Korea)and dissolved in 50 ml of proteomics-grade water. The resulting peptide solutions were applied to LC-MS/MS and bactericidal assay. For the comparison to the result of GE-MPs ILAC, 5 mg of PE:PG (4:1)-immobilized MPs (EG-MPs) were also used to capture hominicin with the same procedure.
-？Characterization of probiotics and antimicrobial peptides
ㆍ Study of resistance to gastric juice, bile-tolerant and adhesion ability of probiotic strains.
ㆍ Amino acid sequencing and structural identification of antimicrobial peptides.
ㆍ Antimicrobial spectrum and cytotoxicity of antimicrobial peptides.
-？Commercialization study of antimicrobial peptides
ㆍ Scale-up of antimicrobial peptide production by using fermenter.
ㆍ Enhancement of antimicrobial activity by substitution of amino acid residues and hybridization of two antimicrobial peptides.
ㆍ Study of maintenance and safety of antimicrobial peptide under extrme conditions.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 요약문...3
• SUMMARY...12
• CONTENTS...20
• 제 1 장 서 론...23
• 1. 필요성...23
• 2. 목적...24
• 제 2 장 국내의 기술개발 현황...26
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...28
• 1. 연구개발의 내용 및 범위...28
• 2. 연구개발의 결과...38
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...56
• 1. 세부연구과제별 목표 대비 달성도...56
• 2. 정량적성과...57
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...61
• 1. 연구결과 활용계획...61
• 2. 연국결과 발전계획...61
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...62
• 제 7 장 기타 중요 변동사항...63
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황...64
• 제 9 장 참고문헌...65