초록 ▼

붉은 곰팡이 병원균(무성세대 : Fusarium graminearum)은 전 세계적으로 널리 분포하며 보리나밀과 같은 맥류의 붉은 곰팡이병, 옥수수의 이삭 및 줄기 썩음병, 그 밖에 많은 식물에 뿌리 썩음병을 야기하여 작물의 수확을 감소시키는 매우 중요한 식물 병원균의 하나이다(Marasas 등, 1984). 특히 이 곰팡이는 Tricothecene과 Zearalenone계의 곰팡이 독소를 생성하여 인축에 치명적인 피해를 초래하기도 한다. 이곰팡이는 1993년 미국 중·서북부에서 이 병의 발생으로 10억달러의 손실을 입어 작물의 붉

붉은 곰팡이 병원균(무성세대 : Fusarium graminearum)은 전 세계적으로 널리 분포하며 보리나밀과 같은 맥류의 붉은 곰팡이병, 옥수수의 이삭 및 줄기 썩음병, 그 밖에 많은 식물에 뿌리 썩음병을 야기하여 작물의 수확을 감소시키는 매우 중요한 식물 병원균의 하나이다(Marasas 등, 1984). 특히 이 곰팡이는 Tricothecene과 Zearalenone계의 곰팡이 독소를 생성하여 인축에 치명적인 피해를 초래하기도 한다. 이곰팡이는 1993년 미국 중·서북부에서 이 병의 발생으로 10억달러의 손실을 입어 작물의 붉은 곰팡이병과 이 병원균에 대한 저항성 육종이 큰 과제로 떠오르게 되었고 (McMullen 등, 1997) 그 중요성에 의해 최근에는 전체 개놈에 대한 염기서열 분석이 완성되고 있는 시점이다. 국내에서도, 1963년에 전국적으로 피해가 보고되기 시작하였으며, 1973년 1990에는 지역적으로 발생현황을 보이다가 1998년에는 전국에 걸쳐 대 발생이 일어나는 등 붉은 곰팡이 병에 의한 피해가 잇었다. 붉은 곰팡이 병에 관한 발생 조사 통계는 표1과 같다. 붉은 곰팡이 병원균에 감염된 식물의 증상을 보면 그림 1과 같이 주로 이삭에서 연갈색 반점이 생기다가 분홍색의 곰팡이가 생기며 갈색으로 변하고 빨리 마르게 되므로 수확의 감소를 가져올 뿐만 아니라 아울러 곰팡이 독소에 의한 오염 때문에 더 심각한 병으로 인지되고 있다. 이러한 병의 심각성과 함께 여러 연구자들은 붉은 곰팜이 병의 방제를 위한 노력을 많이 하고 있으며 화학적 제제를 이용한 방제방법이나 저항성 품종의 개발을 위한 저항성 기작에 관한 연구를 활발히 진해하고 있다. 그러나 이들의 연구 결과에 의하면 병원균의 생장을 억제하는 유전자를 제거하거나 또는 약제를 살포하여도 독소생생은 오히려 증가하는 경우 등 완전한 방제 방법의 개발을 위해서는 아직까지 맣은 어려움이 있는 것으로 여겨지고 있다. 아울러 약제 살포의 경우 병의 방제 ？과가 있더라고 그에 따른 주변 환경 및 생태계 파괴, 유익한 토양 미생물의 살귤 등의 문제점이 있으며, 저항성 유전자를 지닌 품종 개발은 실제로 포장에서 이용하기에는 적용방법이 쉽지 않다는 점과 농산물 안정성 문제 등이 대두되고 있어 이용 가능성에 문제가 있다. 따라서 붉은 곰팡이 병의 안정적인 방제를 위한 연구의 필요성은 더욱 증대되고 있다.

Abstract ▼

Fusarium graminearum is an important plant pathogen that causes head andseedling blight and scab disease of small grains such as wheat, barley and com in Korea. F. graminearum infections were associated with direct economic losses due to lower yields and poor grain quality. Double-stranded RNA (dsRN

Fusarium graminearum is an important plant pathogen that causes head andseedling blight and scab disease of small grains such as wheat, barley and com in Korea. F. graminearum infections were associated with direct economic losses due to lower yields and poor grain quality. Double-stranded RNA (dsRNA) mycoviruses in some fungi are associated with hypovirulence and have been used or proposed as biological control agents. In case of F. graminearum, Fusarium graminearum virus-DK21 (FgV-DK21) which isolated from Korea has been studied that related to a hypovirus that attenuates virulence (hypovirulence) expressing phenotypic traits such as reduced mycelial growth, reduced sporulation, less toxin production but increased pigmentation. To search the more isolates of F. graminearum related to hypovirulence, we isolated the F. graminearum containing the dsRNAs by cellulose CFll chromatography. Among these, we selected 2 isolates such as DK3 and 98-8-60 isolates which the presence of dsRNA did not affect colony morphology and pigmentatation and did associated with morphological changes including reduction in mycelial growth and increased pigmentation, respectively. The dsRNA of these isolates were characterized the full length sequence and transmissibility of progeny conidia and ascospores. The isolate DK3 has two different dsRNA viruses, which are referred to as FgV-3 and FgV-4. FgV-3 consists of one dsRNA fragment and FgV-4 is divided to two dsRNA fragments. The another isolate 98-8-60 has one dsRNA virus containing seven dsRNA fragments, which are refered to as FgV-2. Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequences of RdRp regions revealed that RdRp sequences from isolate 98-8-60 is closely related to family Chrysoviridae. DsRNA1 of isolate DK3 was closely related to the family of Totiviriridae and Chrysoviridae but distantly related within the cluster, whereas dsRNA2 of isolate DK3 formed a distinct clade with the family Partitiviridae. To investigate the transformation technology for transmission of hypovirus using FgV-DK21, we developed the efficient fungal promoter for virus gene overexpression in fugal host cell. EF1 alpha promoter was adapted to fungal transformation with pCBlO04 which DNA based vector containing Hygromycin gene as selection marker. To identify protein of FgV-DK21 related to hypovirulence, each ORF protein for four ORFs was cloned. All clones were transformed to virus-free F. graminearum strain by polyethylene glycol (PEG)-uptake method. As a result, transformants by ORF2 and ORF4 overexpression showed irregular morphology and slow growth rate. This result indicate the ORF2 and 4 of FgV- DK21 are pathogenecity determinants related to hypovirulence. Finally, to test the application of biological control using FgV-DK21 hypovirus to field, we tried the transmission of hypovirulence-rassociated dsRNA between mycelia of F. graminearum. However, transmission beteween mycelia in field is prevented by vegetative incompatibility barrier in filamentous fungi strains. Vegetative incompatibility can be overcome through the use of protoplast fusion. To determine whether FgV-DK21 can overcome vegetative incompatibility barrier, protoplasts was prepared from virus-free recipients, strain DK3 (lineage?'), strain 88-1 (lineagefi), F. culmorum (F39;outgroup), F. oxysporum f. sp. lycopersici (outgroup) and F. meridionale (F34; lineage2) that were transformed with a hygrornycin B resistant gene, and virus-infected donor, strain DK21, were fused by the PEG-mediated method. Colonies regenerated from donor were excluded by growing fused protoplasts on a medium with hygrornycin B. The morphology of colonies rising from virus-infected strains was severely altered from their virus-free strains such as reduction in growth rate and change in pigmentation. We confirmed infection with FgV-DK21 by the presence of genomic dsRNA and by northern blot analysis. We also examined the protoplast fusion method on Fusarium sp., Cryphonectria parasitica and other filamentous fungi to elucidate potential hosts of FgV-DK21. Altogether, these results indicate that protoplast fusion can be used to introduce FgV-DK21 dsRNA in to various filamentous fungi.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 목차...3
• Summary...
• I. 서언...
• II. 연구사...
• III. 재료 및 방법...
• 제 1 세부과제명 : dsRNA mycovirus를 함유하고 있는 저병원성 균주를 이용한 병원성 붉은 곰팡이병의 생물적 방제방법 개발...19
• 1. 붉은 곰팡이 병원균에 dsRNA 바이러스 (FgV-DK21)을 전이시키기 위한 DNA 벡터 개발...19
• 2. 바이러스 전이를 위한 효율적인 방법 개발...19
• 3. FgV-DK21의 저병원성에 관여하는 유전자 구명...19
• 4. 저병원성 유전자를 이용한 효율적인 곰팡이 바이러스 인자의 재조합 벡터 개발...20
• 5. 곰팡이 바이러스의 실용화 기술을 위한 기주특이성 조사 및 환경요인 조사...20
• 제 2 세부과제명 : 붉은곰팡이 병원균에 존재하는 dsRNA mycovirus의 유전적 다양성과 생물적 특성구명...21
• 1. 붉은곰팡이 균주들에서 분리한 곰팡이 바이러스들의 특성조사...21
• 2. 특성이 다른 곰팡이 바이러스를 선별하여 염기서열 정보를 분석...21
• 3. 곰팡이 바이러스간의 염기서열 차이에 따른 병원성 변화의 관계분석...21
• 4. 곰팡이 바이러스에 의해 변화하는 붉은곰팡이 균주의 세포학적 변화 및 유전자발현의 변화 구명...21
• 5. 실용화 적용방법 개발...21
• IV. 결과 및 고찰...23
• 1. dsRNA 바이러스 분리...23
• 2. 붉은 곰팡이 균주에서의 dsRNA바이러스 감염 특성 조사...26
• 3. 특성이 다른 곰팡이 바이러스를 선별하여 염기서열 정보를 분석...28
• 4. 곰팡이 바이러스간의 염기서열 차이에 따른 병원성 변화의 관계분석...36
• 5. 곰팡이 바이러스에 의한 붉은 곰팡이 병원균의 생물학적 변화 구명...41
• 6. 바이러스 전이를 위한 벡터 개발...43
• 7. DNA 벡터를 이용한 곰팡이 형질전환...46
• 8. FgV-DK21의 저병원성에 관여하는 유전자 구명...49
• 9. 저병원성 유전자를 이용한 효율적인 곰팡이 바이러스 인자의 재조합 벡터 개발...53
• 10. 곰팡이 바이러스를 포장에 적용하기 위한 붉은 곰팡이 병균의 기주특이성 조사...58
• V. 적요...64
• VI. 인용문헌...65