초록 ▼

본 연구에서는 히스톤 탈메틸화 효소인 LSD1의 sumoylation과 ubiquitination에 의한 단백질변형이 LSD1의 효소활성 및 세포내 위치 조절기전에서의 역할과 암발생 기전과의 연관성을 규명함으로써 항암제 개발에 유용한 표적분자를 발굴하고자 함.
기존의 연구결과에 따르면 LSD1은 유전자 활성화 또는 불활성화, 이질염색질 안정화 그리고 세포주기 조절 등에 관여하며 이런 기능의 오작동은 암발생의 원인으로 작용할 가능성을 높다고 알려짐. 본 연구에서는 LSD1의 기능조절이 다양한 post-translational m

본 연구에서는 히스톤 탈메틸화 효소인 LSD1의 sumoylation과 ubiquitination에 의한 단백질변형이 LSD1의 효소활성 및 세포내 위치 조절기전에서의 역할과 암발생 기전과의 연관성을 규명함으로써 항암제 개발에 유용한 표적분자를 발굴하고자 함.
기존의 연구결과에 따르면 LSD1은 유전자 활성화 또는 불활성화, 이질염색질 안정화 그리고 세포주기 조절 등에 관여하며 이런 기능의 오작동은 암발생의 원인으로 작용할 가능성을 높다고 알려짐. 본 연구에서는 LSD1의 기능조절이 다양한 post-translational modification과 nuclear import 기작에 의해 이루어질 가능성을 지지하는 증거를 다음과 같이 제시함.
(1) LSD1은 SUMO1과 SUMO2 모두에 의해 변형될 수 있으며, Ubc9-fused LSD1의 in vivo sumoylation assay를 통한 sumoylation site의 위치 확인을 수행한 결과 조사된 5개의 potential sites 이외에도 다양한 리신잔기에서 sumoylation이 일어날 수 있음을 시사함.
(2) LSD1은 세포주기 중 체세포분열 단계에 따라 세포내 위치가 조절됨을 확인함. 흥미롭게도 양성종양세포주나 침윤성 암세포주 모두에서 세포분열 metaphase와 early anaphase 동안에는 염색체와 분리되어 핵내에 위치하지만 late anaphase와 telophase 시기에는 염색체와 동일한 위치에서 염색됨을 확인함. 이와같은 LSD1의 세포주기에 따른 염색체와의 결합향상은 SUMO2 분자와 매우 유사하였으며, 이는 체세포 유사분열동안 LSD1의 세포내 위치 조절에 SUMO1 보다는 SUMO2의 역할이 중요할 것으로 사료됨.
(3) LSD1의 핵내 위치 조절에 필요한 domain을 찾기 위해 LSD1의 deletion mutant를 제조하여 immunostaining으로 조사한 결과, LSD1의 N-flexible region인 1-172aa 부위가 핵내 위치를 결정하는데 중요함을 확인하게 됨. 특히 1-172aa 중에서 101-120aa의 21개 아미노산으로 구성된 부위가 핵으로 이동하는 데 필수적임을 확인하였음. 또한 LSD1의 101-120aa 부위의 putative NLS motif인 112RRKRAK117가 LSD1의 핵으로의 위치이동에 필수적임을 실험적으로 증명함. 이런 결과는 LSD1이 nuclear periphery 부위에 위치하면서 특정 약물처리조건에서만 핵 안으로 이동한다는 결과와는 달리 LSD1은 기본적으로 NLS motif를 이용하여 핵 안으로 이동하여 기능하는 단백질임을 시사하는 것임.
특히 LSD1은 분화가 나쁜 암세포에서 발현양이 높은 것으로 알려져 있는 데, 만약 LSD1의 핵내 이동을 저해하는 약물을 이용하면 LSD1 과발현으로 인한 생긴 암을 치료할 수 있는 근거를 제공할 것으로 기대됨.
(4) LSD1의 기능이 Neddylation과 ubiquitination에 의해 조절되며, 특히 ubiquitin E3 ligase 중 Cul4A-Cul4B-DDB1 complex가 LSD1의 유비퀴틴화에 참여하여 LSD1의 AOL domain에서 주로 ubiquitination이 일어남을 시사하는 것임
(5) LSD1은 mitosis 과정이 아닌 S phase동안 유비퀴틴화와 proteasome의 기능에 의한 단백질 분해를 통해 단백질 수준이 세포주기에 따라 조절되는 단백질임을 시사하는 것임.

Abstract ▼

The goal of this project is to understand the roles of post-translational modifications such as sumoylation and ubiquitination in cellular functions of LSD1 and to analyze the relationship between the modification of LSD1 and carcinogenesis, and thereby identifying the potential targets for developm

The goal of this project is to understand the roles of post-translational modifications such as sumoylation and ubiquitination in cellular functions of LSD1 and to analyze the relationship between the modification of LSD1 and carcinogenesis, and thereby identifying the potential targets for development of anti-cancer therapeutics
Previous reports demonstrated the diverse functions of LSD1 involved in gene regulation, heterochromatin integrity and cell cycle control. Its malfunction may cause human cancers. In this project, we provided experimental evidences supporting that LSD1 functions may be controlled by post-translational modifications and nuclear import pathway.
(1) In vivo sumoylation assay showed that LSD1 could be modified by either SUMO1 or SUMO2 molecules and five potential SUMOylation sites within LSD1 primary sequence are not sufficient for its sumoylation.
(2) Subcellular localization of LSD1 can be controlled via cell cycle progression. LSD1 associated with chromosomes during late analphase and telophase whereas LSD1 is not associated with chromosomes during metaphase and early anaphase. The association pattern of LSD1 with chromosomes is very similar to that of SUMO2 protein but not SUMO1. The data indicate that SUMO2 may be important for localization of LSD1 during mitosis.
(3) Deletion mapping analysis and immunostaining identified the essential role of the N-flexible region (1-172-aa) in nuclear import of LSD1. Particularly 21-aa domain (101-120-aa) may contain a critical motif for its nuclear import. Further analysis showed that 112RRKRAK117가 may play a role as a potential NLS motif. Based on the data, we provide a possibility that blocking the nuclear import of LSD1 may be good target for development of anti-cancer therapeutics.
(4) The LSD1 functions can be controlled by modifications such as neddylation and ubiquitination. In addition, Cul4A-Cul4B-DDB1 complex, ubiquitin E3 ligase, is involved in ubiquitination of LSD1 and the ubiquitination occurs predominantly within AOL domain of LSD1.
(5) The protein level of LSD1 may be controlled via polyubiquitination-mediated proteolysis during S phase.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 목 차 ... 3
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 5
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 6
• (1) 연구개발의 필요성 ... 6
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 10
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 12
• (1) LSD1의 Sumoylation에 의한 변형 ... 12
• (2) LSD1의 in vivo sumoylation assay를 통한 sumoylation site의 위치 확인 ... 12
• (3) Co-immunoprecipitation assay를 이용한 SIM (sumoylation interacting motif)의 조사 ... 13
• (4) LSD1의 sumoylation이 세포내 위치에 미치는 영향 조사 ... 13
• (5) Ubiquitin 사촌인 Nedd8 modification에 의한 LSD1의 기능에 미치는 영향 분석 ... 15
• (6) LSD1의 nuclear import에 필요한 domain mapping ... 16
• (7) LSD1의 ubiquitin에 의한 modification의 분자기작 ... 20
• (8) 세포주기에 따른 LSD1의 단백질 안정화 조 ... 23
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 25
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 26
• (1) 연구성과 총괄 ... 26
• (2) 연구성과 상세내역 ... 28
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 30
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 31
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 31
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 31
• 7. 참고문헌 ... 31
• 8. 첨부서류 ... 32