초록 ▼

-상피세포에서 p63에 의한 p53의 기능조절을 분석하여 p53에 의한 세포사멸 조절 이해
-Sox10의 제어 대상 유전자 동정을 통한 암세포에서의 역할 규명
-C. elegans FANCD2의 발생단계에 특이한 DNA damage response에서의 기능과 세포사멸에서 p53와의 연관성 연구
p53는 p53 family member protein (p63, p73)과의 상호작용으로 세포사멸을 유도 하는데, 상피세포에서는 DNp63a (p63 isoform) 단백질이 p53에 결합하여 세포성장을 조절한다. 본 연구

-상피세포에서 p63에 의한 p53의 기능조절을 분석하여 p53에 의한 세포사멸 조절 이해
-Sox10의 제어 대상 유전자 동정을 통한 암세포에서의 역할 규명
-C. elegans FANCD2의 발생단계에 특이한 DNA damage response에서의 기능과 세포사멸에서 p53와의 연관성 연구
p53는 p53 family member protein (p63, p73)과의 상호작용으로 세포사멸을 유도 하는데, 상피세포에서는 DNp63a (p63 isoform) 단백질이 p53에 결합하여 세포성장을 조절한다. 본 연구에서는 DNp63a 단백질의 sumoylation, ubiquitylation, 또는 acetylation을 조사하고, 이러한 modification이 p53와의 결합과 p53 활성화에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 DNp63a는 DNA damage 같은 외부 신호나 TNF-α같은 생리활성 물질이 유도하는 세포사멸에 대한 저항성을 부여함을 확인하였다. 또한 DNA damage나 TNF-α는 ubiquitin-proteasome pathway를 통해 DNp63a의 분해를 유도하며, sumoylation은 PML targeting과 전사억제 능력을 증가시킨다. Acetylation 의 확인 과정에서는 DNp63a가 복합체로 존재하고 acetylation이 통제된다는 것을 확인하였다.
Sox10의 제어대상 유전자를 발굴하고 직간접 대상으로 분류하기위해 최근 개발된 일련의 기법을 순차적으로 적용하였다. 즉 RNA interference, microarray profiling, comparative genomic analysis, chromatin immunoprecipitation을 구사하여 다수의 직접 제어 대상을 melanoma와 schwannoma에서 발굴하였다. 추가로 Sox10이 schwannoma의 분화상태 유지에 필요하다는 것을 밝혀냄으로써 교차분화의 기전 규명에 유용한 시스템을 제시하였다.
사람 Fanconi anemia와 관련된 12개의 protein중 하나인 FANCD2의 C. elegans homolog에 대하여, 그 knockout strain을 사용하여 C. elegans 발생에서의 역할을 조사하였다. 또한, 생식선과 배아에서 DNA crosslink와 double-stranded DNA break repair에서 FANCD2의 기능을 측정하였다. FANCD2의 결실에 따른 apoptosis의 증가 에서 p53와의 관계를 분석하고, 세포내 위치를 면역염색으로 확인하였으며, coelomocyte의 endocytosis에 미치는 영향도 조사하였다.
p53는 유전 정보를 보호 유지하는 기전에서 가장 중심에 있는 단백질인 만큼 암생 물학자만이 아니라 모든 생물학 분야에서 관심의 대상이 되고 있는 단백질이다. 상피 암세포나 상피 줄기세포의 경우 p63의 isoform인 DNp63a에 의해 p53의 기능이 조절되는 것으로 알려져 있다. 따라서 p63의 단백질 변형에 따른 regulation을 밝힌 본 연구는 상피 줄기세포나 상피암의 세포 증식과 사멸을 조절하는데 중요한 단서를 제공 하며 항암제의 screening에도 이용될 수 있다 (BBRC 2006 출판. 국제 논문 2편 투고 예정, 국내특허 2 편).
전사제어인자의 직접 조절대상 동정기법과 교차분화의 기전을 연구할 수 있는 in vitro 시스템의 개발하였고, Sox10의 발현억제가 schwann 세포를 평활근세포로 교차 분화 유도함을 입증하였다 (Differentiation 2006 출판. 국제논문 1 편 작성예정).
C. elegans FANCD2 homolog는 spontaneous DNA damage와 DNA crosslink의 repair에 작용하며, 그 작용은 증식하는(mitotic) 생식세포 뿐만 아니라 homologous recombination이 활발히 진행되는 promeiotic pachytene stage 생식세포에서도 관찰되 었다. 또한 embryo에서는 FANCD2가 double-stranded DNA break repair에도 부가 적인 역할을 함을 관찰하였고, 예상외로 coelomocyte의 endocytosis에서의 영향도 감지하였다. 본 연구결과는, FANCD2의 cell type과 발생단계에 따른 다양한 활성을 보여줌으로써 Fanconi anemia의 병리학적인 발병기작을 이해하는데 기여할 것이다 (BBRC 2006 1 편 게재허가. 국제 논문 1 편 작성 예정)

Abstract ▼

-Understanding the mechanism of p53 mediated apoptosis through functional analyses of p53 regulation by p63 in epithelial cells
-Functional analysis of Sox10 in melanoma and schwannoma via identification of regulatory targets
-Understanding the function of FANCD2 homolog in C. elegans and anal

-Understanding the mechanism of p53 mediated apoptosis through functional analyses of p53 regulation by p63 in epithelial cells
-Functional analysis of Sox10 in melanoma and schwannoma via identification of regulatory targets
-Understanding the function of FANCD2 homolog in C. elegans and analyzing the mechanism of interaction with p53
In epithelial cells, p63 isoform DNp63a controls p53 for the regulation of cell growth. We characterized the molecular nature of modification of p63 protein and determined the role in interaction with p53 including the effect on the activity of p53. We found that DNp63a confers resistance to cell death invoked by DNA damages and the inflammatory cytokine TNF-a. Furthermore, the DNA damage and TNF-a induced degradation of DNp63a through ubiquitin-proteasome pathway. Thus ubiquitylation controls the stability of DNp63a. Sumoylation, on the otherhand, regulates PML targeting and transcription repression by DNp63a. In the study of acetylation, we found that DNp63a exists as a complex with multiple acetyl transferases and deacetylases which would control the acetylation upon various cellular stresses.
A new protocol was developed for identification of regulatory targets of Sox10.
The procedure is based on a serial application of RNA interference, microarray expression profiling, comparative genomic analysis, and chromatin immunoprecipitation. Several direct target genes were discovered in melanoma and schwannoma. In addition, a novel function of Sox10 was discovered. Sox10 is responsible for maintaining glial phenotypes of schwannoma cells wherein the downregualtion of Sox10 induces an apparent transdifferentiation into smooth muscle cells.
FANCD2 is one of the 12 proteins associated with Fanconi anemia. We investigated the role of the C. elegans FANCD2 homolog in the development and developmental-stage specific DNA damage responses. By analyzing the knockout phenotypes, its function in the repair of spontaneous DNA damage and exogenously induced DNA crosslinks was found in germ cells and also the function in the repair of double-stranded DNA breaks was detected in the embryos. Enhanced apoptosis due to the FANCD2 deficiency was dependent on p53, and the protein was localized in the nuclei. Unexpectedly, a novel role of the FANCD2 in endocytosis by coelomocytes was found.
p53, in accordance with its role as the protector of genetic information, is the protein of interest to biologists of all fields. How p53 determines the fate of diverse types of cells is a key research agenda in numerous labs around the world. Cancers in epidermal origin as well as epidermal stem cells utilize DNp63a to regulate p53. Therefore our study on the post translational modification of p63 provides means to regulate cellular growth and death of those cell types and can be applied to screening of anti-cancer agents (BBRC 2006, two manuscripts in preparation, Korean patents 2)
A procedure of identifying direct regulatory targets of transcription factors and an in vitro system for studying the mechanism of transdifferentiation were established. In addition, the knockdown of Sox10 was found to induce an apparent transdifferentiation of Schwann cells into smooth muscle cells. (Differentiation 2006, one additional manuscript in preparation)
The C. elegans FANCD2 homolog participates in the repair of spontaneous DNA damage and DNA crosslinks, not only in proliferating cells but also in pachytene stage cells, and it may have an additional role in double-stranded DNA break repair during embryogenesis. A further study on the role of the FANCD2 in endocytosis of coelomocytes may give a clue to the congenital deformations in Fancoi anemia patients. The developmental stage-specific activities of FANCD2 homologs may lead to a better understanding of the pathologies seen in Fanconi anemia. (BBRC 2006 in press, one manuscript in preparation)

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문...4
• 2. 영문요약문...5
• Ⅲ. 연구내용...6
• 1. 서론...6
• 가. 연구배경...6
• 나. 연구목표...9
• 다. 연구내용 및 범위...9
• 2. 연구방법 및 이론...11
• 3. 결과...18
• 가. 상피세포에서 p63에 의한 p53의 기능조절을 분석하여...18
• 나. Sox10의 제어 대상 유전자 동정을 통한 암세포에서의 역할 규명...31
• 다. FANCD2 homolog의 C. elegans에서의 기능과 p53와의 상호 관계 p53와의 상호 관계...48
• 4. 고찰 및 결론...58
• 5. 인용문헌...62
• 6. 연구성과...64