초록 ▼

마비성패류독소의 분석은 AOAC 959.08 official method (OM)에 근거한 mouse bioassay (AOAC MBA)를 표준법으로 하여 전 세계적으로 이루어지고 있으나 정량한계가 높으며 독성 프로파일에 대한 정보를 얻을 수 없는 단점을 가지고 있다. 그래서 이 연구에서는 pre- 및 post-column oxidation 법과 LC-MS/MS에 관한 선행연구를 검토하고 우리나라 시료특성에 부합되는 분석조건을 수립한 후 동 시험법에 대한 유효성 확인을 실시하여 모니터링과 규제를 목적으로 한 분석환경에 사용될 수 있

마비성패류독소의 분석은 AOAC 959.08 official method (OM)에 근거한 mouse bioassay (AOAC MBA)를 표준법으로 하여 전 세계적으로 이루어지고 있으나 정량한계가 높으며 독성 프로파일에 대한 정보를 얻을 수 없는 단점을 가지고 있다. 그래서 이 연구에서는 pre- 및 post-column oxidation 법과 LC-MS/MS에 관한 선행연구를 검토하고 우리나라 시료특성에 부합되는 분석조건을 수립한 후 동 시험법에 대한 유효성 확인을 실시하여 모니터링과 규제를 목적으로 한 분석환경에 사용될 수 있는지 확인하고자 하였다.
일부 독소성분의 분리가 되지 않는 pre-column oxidation HPLC법 보다는 동물시험법과 동일한 시료 전처리법을 이용하고 모든 독소성분의 분리가 가능한 post-column oxidation HPLC법을 선택하여 분석조건을 우리나라 패류시료의 매트릭스 특성에 맞도록 최적화하였다. 그 결과 얻어진 회수율은 83.5% 이상이었으며 반복시험에서 나타난 표준편차는 7% 이하로 AOAC international의 기준에 부합되었다. 총 독소에 대한 정량한계는 최고 8.6 μg/100g 수준으로 총 독소에 대한 AOAC MBA에 비하여 약 4.6배 이상의 향상된 분석능력을 가진 것으로 확인되었다. 그리고 동물시험법(AOAC MBA)과 비교한 결과 굴과 진주담치 매트릭스에서 상관계수가 각각 0.9534와 0.9109로 매우 좋은 상관관계를 나타내었다.
이 연구에서 검토한 두 번째 기기분석 방법인 LC-MS/MS법은 분석표준물질을 사용하여 확인한 결과, GTXs-STXs와 C toxins의 동시분석이 가능하였으나 spiked sample에 대한 회수율이 53.5-91.0%로 나타났다. 산 추출과 용매 및 카트리지를 이용한 정제단계를 조합한 5가지 전처리법을 검토하였으나 dcSTX와 C toxins에 대한 회수율이 개선되지 않아 향후 다양한 패류 매트릭스의 영향을 배제할 수 있는 전처리법의 검토와 그에 따르는 시험조건의 최적화가 필요할 것으로 사료된다.
Post-column oxidation HPLC법을 이용하여 우리나라 연안에서 양식되는 이매패류 중 생산량이 많고 상업적 가치가 높은 굴(Crassostrea gigas)과 진주담치(M ytilus galloprovincialis)에 대하여 마비성 패류독소 프로파일을 조사한 결과, 굴의 경우 주된 독소 성분은 3월에서 4월 중에는 GTX2로 나타났으며 5월부터는 GTX4와 GTX1이 주요 독소로 확인되었다. 진주담치의 경우 주된 마비성패류독소 성분은 3월에서 4월 중순에는 GTX3, GTX2 및 STX로 나타났으며 최고치에 도달한 4월 하순에서 5월 초까지는 STX와 GTX2가 주요 독소로 확인되었다. 그리고 전 시료에서 C toxins은 검출되지 않았다. 굴과 진주담치에서 기기분석을 통해 계산된 총독소량은 동물시험법과 잘 일치하였다.
이 연구결과는 우리나라 마비성 패류독소 시험법 개정을 위한 기초자료로 제공될 것이다.

Abstract ▼

Though AOAC Mouse Bioassay Analysis (MBA) method has high limit of quantification and can not determine toxic profile, this method has been gold standard for analysis of paralytic shellfish poisoning toxin (PSP toxin) for more than 50 years. We reviewed the reports related to alterative analysis met

Though AOAC Mouse Bioassay Analysis (MBA) method has high limit of quantification and can not determine toxic profile, this method has been gold standard for analysis of paralytic shellfish poisoning toxin (PSP toxin) for more than 50 years. We reviewed the reports related to alterative analysis method for PSP toxin such as pre- and post-column HPLC method and LC-MS/MS method and optimized analysis conditions of them for Korean shellfish to establish the alternative method for PSP analysis intended to be used under environment of official monitoring and regulation.
Because several toxin components were not differentiated by pre-column oxidation HPLC method, post-column oxidation HPLC method (PCOX) was selected and optimized. The recovery of PCOX method was over 83.5% and the standard deviation was below 7%, which met the criteria of AOAC International for single-lab method validation. The limit of quantification for total toxin was about 8.6 μg/100g and this was a 4.6-fold improvement in the detection capability of the method over the conventional AOAC MBA. The results of long term comparison study showed good correlation of the PCOX results to the results obtained by the AOAC MBA as correlation factor was 0.9534 and 0.9109 for oyster and mussel matrix, respectively.
The analysis results of reference material by LC-MS/MS method showed very resonable and total analysis time was just 15 minutes but the recovery of toxins in spike sample was 53.5-91.0%. We tried to remove matrix effect using 5 different extraction and purification methods but the recoveries of dcSTX, C1 and C2 were not improved. We are planning to carry out further study and cooperative study with the expert group in EC and Canada.
We applied PCOX method to analyze field sample collected in the coastal area of Korea where the PSP occurrence is common. The shellfish was oyster (Crassostrea gigas) and mussel (M ytilus galloprovincialis), which were commercially valuable shellfish species and the production amounts were also high every year in Korea. The toxin profiles and total toxin amount were examined and GTX2 (during March-April) and GTX4 and GTX1 (in May) were predominant toxin components in oyster. During March-April, GTX3, GTX2 and STX was predominant toxin components in mussel and STX and GTX2 were major toxin components. In June toxin levels were sharply decreased in both shellfish species and C toxins were not detected during the survey period. The total toxin amount analyzed by PCOX and MBA showed good correlation, also.
The results of this study will be used for the revision of the Koran Official Method for paralytic shellfish poisoning toxin.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 5
• Ⅰ. 연구개발과제 요약문 ... 9
• 국문 요약문 ... 9
• Summary ... 11
• Ⅱ. 연구개발과제 연구결과 ... 13
• 제1장 연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 13
• 1절 연구개발과제의 목표 ... 13
• 1. 마비성패류독소의 국내외 발생동향 및 역사 ... 13
• 2. 연구배경 및 목적 ... 25
• 3. 연구범위 ... 26
• 2절 연구개발과제의 목표달성도 ... 27
• 3절 국내 • 외 기술개발 현황 ... 27
• 1. 동물시험법(mouse bioassay) ... 27
• 2. 액체 크로마토그래피 ... 28
• 3. 질량분석법 ... 29
• 4절 연구개발과정에서 수집한 국외과학기술정보 ... 31
• 1. 캐나다 식품검역소 마비성패류독소 분석법 개발 현황 ... 31
• 제2장 연구개발과제의 내용 및 방법 ... 32
• 1. Post-column oxidation HPLC법 검토 ... 32
• 2. LC-M S/M S법 검토 ... 38
• 3. 기기분석법을 이용한 연안산 패류 중 마비성패류독소 함량 및 구성성분 분석 ... 45
• 제3장 연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 46
• 1. Pre-column oxidation HPLC법 검토 ... 46
• 2. Post-column oxidation HPLC법 검토 ... 48
• 3. LC-M S/M S법 검토 ... 66
• 4. 기기분석법을 이용한 연안산 패류 중 마비성패류독소 함량 및 구성성분 분석 ... 73
• 5. 기기분석법과 동물시험법의 비교 ... 75
• 6. 요약 및 결론 ... 78
• 제4장 연구개발과제의 연구성과 ... 81
• 1. 활용성과 ... 81
• 2. 활용계획 ... 86
• 제5장 주요연구 변경사항 ... 87
• 제6장 참고문헌 ... 88
• 제7장 첨부서류 ... 94
• 1. 마비성패류독소 STX s-GTX s 및 C toxins 분석 측정불확도 추정 보고서 ... 94