초록 ▼

동물대체시험법 국제협력(ICATM)이 결성된 이후 세계적으로 실험동물사용에 대한 억제가 강화되고 있다. 이에 우리 식품의약품안전청도 2009년에 in vitro 역가시험법을 위한, 적합한 일본 뇌염바이러스 중화단클론항체를 제작하였고, 2010년에는 이 단클론항체를 이용하여 항원량측정in vitro 역가시험법(ELISA)을 개발하였다.
새로 개발된 in vitro 동물대체 역가시험법(ELISA)이 기존 시험법인 in vivo 플라크수감소율(PRN50) 동물시험법에 대해 대체 가능함을 확인하기 위하여 ELISA kit의 품질분석과

동물대체시험법 국제협력(ICATM)이 결성된 이후 세계적으로 실험동물사용에 대한 억제가 강화되고 있다. 이에 우리 식품의약품안전청도 2009년에 in vitro 역가시험법을 위한, 적합한 일본 뇌염바이러스 중화단클론항체를 제작하였고, 2010년에는 이 단클론항체를 이용하여 항원량측정in vitro 역가시험법(ELISA)을 개발하였다.
새로 개발된 in vitro 동물대체 역가시험법(ELISA)이 기존 시험법인 in vivo 플라크수감소율(PRN50) 동물시험법에 대해 대체 가능함을 확인하기 위하여 ELISA kit의 품질분석과 특성분석 및 시험법 밸리데이션, 다기관 공동 비교시험과 그 결과에 대한 통계적 비교분석을 실시하였다. 이러한 연구결과로 단클론항체 ELISA 키트의 품질관리 항목을 설정하였고, ELISA 키트의 안정적 대량생산을 위한 기반을 확보하였다.
또한 키트 제작에 사용된 단클론항체에 대한 Epitope mapping 특성 분석결과, 코팅 항체는 conformational epitope, conjugate는 linear epitope로 ELISA 키트가 이형 타입의 epitope로 제작되었기에 ELISA 실험시 특이도·민감도가 향상될 것으로 기대하였다.
ICH 가이드라인에 따라 실시한 in vitro 동물대체 역가시험법(ELISA)의 분석 밸리데이션 결과는 직선성, 정확성, 정밀성, 범위의 모든 허용기준을 만족하였다.
이러한 키트 품질분석 확립, 사용된 단클론항체에 대한 특성분석 검증, 밸리데이션을 통한 시험법의 확립으로 in vitro 동물대체 역가시험법이 일본뇌염백신에 대한 역가 및 확인 시험법으로 적합하다고 판단하여 4개 기관간 in vivo vs. in vitro 공동 비교시험과 통계적 비교분석을 실시하였다.
그 결과 이 분석법은 약 4주 걸리던 동물실험을 일체의 전처리 과정없이 단 4시간만에 모든 분석이 완료하는 신속성과 편리성을 지니면서도 기존 in vivo 역가시험법이 지닌 숙달도·실험기관간 편차를 줄이고, 각 배치의 품질관리 시험에서 정확성 향상, 기관간 분석시 정밀성 향상 및 백신 정량화를 통해 매우 우수한 재현성을 지닌 역가 시험법임을 확인하였다. 또한 추가시험으로 실시한 2011년 시판 백신에 대한 시험법간 필드 비교시험과 상관성 시험을 통해 in vivo 역가시험법이 배치간 원액 특성을 정확히 구분하여 백신의 생산경향을 파악할 수 있고, 부적합 배치를 부적합으로 판정할 수 있음을 확인하였다.
결론적으로, 이번 연구과제를 통해 일본뇌염백신의 품질관리 시험방법으로서 현재 적용중인 in vivo 역가시험법을 대체할 수 있는 in vitro 역가시험법(ELISA)을 최종 확립하였다

Abstract ▼

Since foundation of ICATM (International Cooperation on Alternative Test Methods), the animal testing has been difficult more and more.
Therefore, to join with these 3R (Replace, Reduction, Refinement) movement, KFDA developed the construction of neutralizing JEV (Japanese Encephalitis Virus) E m

Since foundation of ICATM (International Cooperation on Alternative Test Methods), the animal testing has been difficult more and more.
Therefore, to join with these 3R (Replace, Reduction, Refinement) movement, KFDA developed the construction of neutralizing JEV (Japanese Encephalitis Virus) E monoclonal antibodies (2009') and established in vitro potency assay (ELISA) of antigen titer for JE vaccine using monoclonal antibody (2010').
To verify in vitro potency assay (ELISA) which can be substituted for the existing in vivo potency assay (PRNT50), we performed quality control testing of ELISA kit, analysis of its own characterization, testing method validation, comparison test and statistical analysis in multi-site collaborative study's results. In this study, we made testing items for release of the ELISA kit and set up the system for the ELISA kit's mass production. Also, through the epitope mapping of monoclonal antibodies for ELISA kit, we found that coating antibody has a conformational epitope and conjugate has a linear epitope. so the using of the antibody would increase the specificity and sensitivity in testing.
Also when method validation was done according to the ICH guidelines, the in vitro potency assay was meets all acceptance criteria of linearity, accuracy, precision and range.
After method validation, we decided that this in vitro potency assay would be proper as a potency and identification method for JE vaccine and performed the collaborative study in four laboratories and statistical analysis.
As results, in vitro potency assay show it's faster (4 weeks → 4 hours) and easy to perform without pre-treatment such as a mouse immunization. Also it has better precision and reproducibility comparing to the conventional in vivo assay. As additional experiments, including comparison about JE vaccines and correlation with these two tests, we know that in vitro potency assay can reflect the characteristics of the each vaccine lot and in vivo and in vitro assay have very similar trend in stressed temperature condition.
In conclusion, we established alternative method (in vitro assay) to the in vivo assay, requiring the animal and many times as an the official quality control method of potency test of the JE vaccine.

목차 Contents

• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 1
• 표지 ... 2
• 요약문 ... 4
• Summary ... 5
• 목차 ... 6
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 7
• 제1절 연구개발과제의 목표 ... 7
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 8
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 10
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 11
• 제1절 연구개발의 내용 및 범위 ... 11
• 제2절 연구개발의 결과 ... 18
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 80
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 81
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 82
• 제1절 활용성과 ... 82
• 제2절 활용계획 ... 82
• 제7장 참고문헌 ... 83