초록 ▼

본 연구에서는 질량분석기와 형광 HPLC를 이용한 바이오의약품의 N- 및 O-당사슬 분석법 확립하고, 질량분석기 (MALDI-TOF MS spectrometry)를 이용한 당사슬 프로파일 및 서열 분석법을 확립하였음. 시료는 소 유래의 페튜인 (fetuin)과 당단백질 의약품인 EPO (erythropoietin)를 모델 당단백질로 하여 각각 PNGase F와 화학적 방법을 이용한 N- 및 O-당사슬 유리 방법을 확립하고, solid phase extraction을 이용한 표준화된 분리 정제 방법을 확립함. 또한, 질량분석장비를 이

본 연구에서는 질량분석기와 형광 HPLC를 이용한 바이오의약품의 N- 및 O-당사슬 분석법 확립하고, 질량분석기 (MALDI-TOF MS spectrometry)를 이용한 당사슬 프로파일 및 서열 분석법을 확립하였음. 시료는 소 유래의 페튜인 (fetuin)과 당단백질 의약품인 EPO (erythropoietin)를 모델 당단백질로 하여 각각 PNGase F와 화학적 방법을 이용한 N- 및 O-당사슬 유리 방법을 확립하고, solid phase extraction을 이용한 표준화된 분리 정제 방법을 확립함. 또한, 질량분석장비를 이용하여 당사슬 프로파일 분석 방법을 확립하고, 순차적인 exoglycosidase 처리 및 tandem mass를 이용한 fragmentation 방법으로 당사슬 서열을 분석하는 방법을 확립하여 표준화함.
특히, 정량성이 부족한 질량분석법을 보완화기 위해 형광발색단
2-aminobenzamide를 이용한 HPLC 분석 방법을 확립하고, 표준화함. 나아가 HPLC-MALDI 연계 시스템을 구축함으로써 두 방법의 장점을 모두 살린 통합적인 분석 방법을 확립함.
본 연구결과는 당단백질 의약품의 구조분석 기반확립 및 제품별 평가시스템 구축을 통한 바이오의약품의 안전성을 확보하고, 국내 취약한 당구조분석 인프라 구축에 기여하여 국내 바이오의약품 개발 연구자 및 회사에 가이드라인을 제시하게될 것임. 또한, 당단백질의약품 개발 전문인력의 교육에 활용하고자 한국당과학회와 공동으로 워크숍을 개최하여 당단백질 의약품 연구 및 개발자에게 자료 제공하였으며, 당분석 SOP를 발간/제공함.

Abstract ▼

Through this project, N- and O-glycan analyses for therapeutic glycoproteins using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-time of flight (TOF) mass spectrometry and high performance liquid chromatography (HPLC) were established. To set up the standardized methods for glycan analysis, we

Through this project, N- and O-glycan analyses for therapeutic glycoproteins using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-time of flight (TOF) mass spectrometry and high performance liquid chromatography (HPLC) were established. To set up the standardized methods for glycan analysis, we used bovine fetuin derived from fetal calf and erythropoietin (EPO), which is a famous blockbuster therapeutics, as model glycoproteins. Their N- and O-glycans were released by peptide N-glycosidase (PNGase) F treatement and various chemical methods, respectively and then purified by solid phase extraction chromatography. In addition, the methods for glycan profile analysis using mass spectrometry instruments were established. The glycan sequencing analysis were also established and standardized by the combined methods using sequential exoglycosidase digestions and tandem mass fragmentation.
In particular, for compensating the semi-quantitative features of MALDI-TOF analysis, HPLC-bassed profiling analysis of fluorescent dye-tagged N-glycans was established to provide quantitative information robustly and reproducibly. The combined methods using HPLC and MALDI-TOF instruments were successfully employed to characterize and monitor glycosylation patterns of therapeutic glycoproteins.
Our results will build the foundation for the structural analysis of therapeutic glycoproteins and contribute to the establishment of evaluation systems ensuring the safety of biotherapeutics. Furthermore, it will lead to the suggestion of guidelines for the biopharmaceutical researchers and companies. In addition, we held a workshop together with Korean Society for Glycoscience to provide the latest trend and information for glycan analysis to them.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• I. 총괄연구개발과제 요약문 ... 7
• 1. 국문요약문 ... 7
• 2. 영문요약문 ... 9
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 11
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 11
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 20
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 24
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 26
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 28
• 제6장 총괄참고문헌 ... 28
• 제7장 총괄첨부서류 ... 28
• III. 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 29
• 제1장 제1세부 연구개발과제 요약문 ... 30
• 제2장 세부연구개발과제의 목적 ... 32
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 34
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 42
• 제5장 세부참고문헌 ... 62
• IV. 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 65
• 제1장 제2세부 연구개발과제 요약문 ... 65
• 제2장 세부연구개발과제의 목적 ... 67
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 70
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 75
• 제5장 세부참고문헌 ... 93
• 별첨. 당단백질 N- 및 O-당사슬 분석 SOP안 ... 94