초록 ▼

NIBRG-14 바이러스주를 임상시험용 및 향후 백신 제조 허가 시 생산용 seed로 확보하기 위하여 GMP(Good manufacturing practice, 이하 GMP)시설에서 Master & working seed bank를 구축하였고 품질 평가를 위하여 seed virus bank들의 바이러스 아형(subtype)을 혈청학적으로 동정하고 오염여부 확인하여 순도(purity)를 결정하였다.
1차년도 연구 과제에서 확립된 소규모 생산 공정을 기반으로 자동화 대량의 생산 공정으로 전환 시 필요한 배양 및 정제공정의 각종 조

NIBRG-14 바이러스주를 임상시험용 및 향후 백신 제조 허가 시 생산용 seed로 확보하기 위하여 GMP(Good manufacturing practice, 이하 GMP)시설에서 Master & working seed bank를 구축하였고 품질 평가를 위하여 seed virus bank들의 바이러스 아형(subtype)을 혈청학적으로 동정하고 오염여부 확인하여 순도(purity)를 결정하였다.
1차년도 연구 과제에서 확립된 소규모 생산 공정을 기반으로 자동화 대량의 생산 공정으로 전환 시 필요한 배양 및 정제공정의 각종 조건(parameter)들을 재확립하였으며 바이러스의 불활화공정을 최적화하여 대량 생산 공정을 확립 하였다.
원액 및 완제품의 품질관리를 위해 단계별 품질평가 기준 및 시험법을 확립하였고 이것을 바탕으로 백신의 안정성(stability) 시험을 실시하였다. 임상시험용 백신과 동일한 제형 및 포장용기를 사용하여 확립된 생산 공정으로 생산된 시료를 냉장보관 하면서 주기적으로 품질검사를 통해 임상시험에서의 시험백신 및 향후 비축백신의 유효기간을 설정하기 위하여 장기 안정성시험을 실시하고 있다.
임상시험에 앞서 독성 및 투여용량을 설정하는 데 적절한 정보를 제공하기위하여 비임상 독성시험을 실시하였다. 독성 시험은 랫드(Rat)와 비글견(Beagle dog)을 사용하여 단회독성시험, 2주 반복 용량결정시험, 6주 반복 4주 회복시험을 실시하였으며 안전성 약리시험을 통해 중추신경계, 호흡기계, 순환기계에 미치는 영향을 조사하였다. 시험 백신은 임상예정용량의 0.5배, 1배, 2배의 항원량을 실험동물에 주사한 결과 특이한 부작용 및 독성은 발견되지 않았다.
백신의 유효성을 입증하기위해 실시한 효력시험에서 마우스(Mouse)와 페렛(Ferret) 실험동물을 사용하여 항체형성 및 야생바이러스주로 공격(challenge)시 방어능력을 보았으며 그 결과 clade1 뿐 아니라 clade2.2에 속하는 바이러스에 대해서도 교차 면역원성을 보였다.

Abstract ▼

To establish master & working seed virus banks, NIBRG-14 strain was cultivated in fertilized eggs at GMP (Good Manufacturing Practice) facility. The seed virus banks were characterized in terms of sterility, identity, and infectivity.
To achieve high purity and effective inactivation, large scale

To establish master & working seed virus banks, NIBRG-14 strain was cultivated in fertilized eggs at GMP (Good Manufacturing Practice) facility. The seed virus banks were characterized in terms of sterility, identity, and infectivity.
To achieve high purity and effective inactivation, large scale production process was established by optimizing the purification and inactivation conditions which were derived from the previous study period.
Assay methods and test specifications were established for quality control of bulk, final bulk and final product; vaccine stability was tested according to these methods and specifications. To determine the expiration date, the vaccine with exactly the same formulation as the final product has periodically been tested for long term stability; it will later be used for clinical study.
To obtain the information for toxicology and appropriate injection dose before clinical study, nonclinical toxicity test was performed and the injection dose limit and side effects were determined in rats and beagle dogs. Single-dose toxicity test, 2 weeks dose range finding test, and 6 weeks repeated dose toxicity with 4 weeks recovery test were performed with 0.5X, 1X, and 2X antigen doses. Pharmacological safety test was tested in central nervous system, respiratory system and cardiovascular system. We conclude that the candidate clade 1 H5N1 inactivated whole-virion vaccine adjuvanted with aluminum can not induce any severe side effects or toxicity.
We confirmed that the adjuvanted whole-virion vaccine of NIBRG-14 (H5N1, clade 1) successfully elicited neutralizing antibody reaction that could provide protection against heterologous A/EM/Korea/W149/06 (H5N1, clade 2.2) virus challenge in ferrets.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• I. 연구개발결과 요약문 ... 5
• (한글) 최종결과보고서 요약문 ... 6
• (영문) Summary ... 7
• II. 학술연구용역사업 연구결과 ... 8
• 제1장 최종 연구개발 목표 ... 9
• 1.1 목표 ... 9
• 가. 연구개발의 최종 목적 ... 9
• 나. 당해 연도 연구 목적 ... 9
• 다. 연구배경 ... 10
• 1.2 목표달성도 ... 12
• 1.3 국내·외 기술개발 현황 ... 12
• 가. 세계보건기구 (WHO) ... 12
• 나. 국내∙외 백신 개발 및 허가현황 ... 13
• 제2장 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 16
• 2.1 백신 생산용 바이러스주 확립 ... 16
• 가. 백신 생산용 바이러스 주 확보 ... 16
• 나. Master / Working seed virus bank 제작 ... 17
• (1) Master seed bank 제작 ... 17
• (2) Working seed bank 제작 ... 17
• 2.2 백신의 대량 생산 공정 확립 ... 19
• 가. 후불활화 조건에 의한 생산공정의 확립 ... 19
• (1) 배양 ... 19
• (2) 정제 ... 20
• (3) 제형화 (Formulation) ... 22
• 나. 후불활화 공정에 의한 정제공정 확립 ... 24
• (1) 불활화 kinetics 검증 ... 24
• 2.3 안정성 시험 ... 25
• 가. 개요 ... 25
• 나. 검체의 제조 ... 25
• (1) 장기안정성 시험용 검체 정보 ... 25
• (2) 장기안정성 시험조건 및 보관장소 ... 25
• 다. 시험방법 ... 25
• (1) 장기안정성 시험 항목 및 기준설정 ... 25
• (2) 시험주기별 시험계획 ... 27
• 2.4 비임상 독성시험을 통한 안전성 확인 ... 28
• 가. 비임상 독성시험 ... 28
• (1) 설치류 (랫드) 단회투여 독성시험 ... 28
• (2) 설치류 (랫드) 2주 반복 용량결정시험 ... 29
• (3) 설치류 (랫드) 6주 반복 4주 회복 근육 투여 시험 ... 32
• (4) 비설치류 (비글견) 2주 반복 용량결정시험 ... 38
• (5) 비설치류 (비글견) 6주 반복 4주 회복 근육 투여 시험 ... 39
• 나. 비임상 약리시험 (In vivo 생물학적/약리학적 활성) ... 45
• (1) 중추신경계(Central Nerverous System, CNS)에 미치는 영향 ... 45
• (2) 순환기계, 심혈관계(Cadiovascular System)에 미치는 영향 ... 48
• (3) 호흡기계(Respiratory System)에 미치는 영향 ... 50
• 2.5 비임상 효력시험을 통한 면역원성 및 유효성 평가 ... 53
• 가. 시험백신의 준비 ... 53
• (1) Mouse 에서의 면역원성 및 유효성 평가를 위한 백신의 준비 ... 53
• (2) Ferret 에서의 면역원성 및 유효성 평가를 위한 백신의 준비 ... 53
• 나. 시험방법 ... 54
• (1) Mouse 에서의 면역원성 및 유효성 평가 ... 54
• (2) Ferret 에서의 면역원성 및 유효성 평가 ... 59
• 제3장 최종 연구개발 결과 ... 63
• 3.1 백신 생산용 바이러스주 확립 ... 63
• 가. 백신 생산용 바이러스주 확보 ... 63
• 나. Master / Working seed bank 제작 ... 63
• (1) Master seed bank 제작 ... 63
• (2) Working seed virus bank 제작 ... 63
• (3) Seed bank 제작에 사용된 부화란 자료 ... 63
• 다. Master / Working seed bank 품질 분석 ... 64
• (1) Master seed 품질 분석 결과 ... 64
• (2) Working seed 품질 분석 결과 ... 64
• 3.2 백신의 대량 생산공정 확립 ... 66
• 가. 후불활화 조건에 의한 생산공정의 확립 ... 66
• (1) 정제 원액 제조 및 분석 ... 66
• (2) 최종원액, 완제의약품 제조 및 분석 ... 66
• 나. 후불활화 공정 검증 ... 68
• (1) 불활화 kinetics 검증 ... 68
• 3.3 안정성 시험 ... 69
• 가. 0개월(2009년 2월 27일 개시) 및 3개월(5월 27일 수행) 안정성시험 ... 69
• 나. 6개월 안정성시험 ... 69
• 3.4 비임상 독성시험을 통한 안전성 확인 ... 70
• 가. 비임상 독성시험 ... 70
• (1) 설치류 (랫드) 단회투여 독성시험 ... 70
• (2) 설치류 (랫드) 2주반복 용량결정시험 ... 70
• (3) 설치류 (랫드) 6주 반복 4주 회복 근육 투여 시험 ... 70
• (4) 비설치류 (비글견) 2주 반복 용량결정시험 ... 71
• (5) 비설치류 (비글견) 6주 반복 4주 회복 근육 투여 시험 ... 71
• 나. 비임상 약리시험 (In vivo 생물학적/약리학적 활성) ... 72
• (1) 중추신경계(Central Nerverous System, CNS)에 미치는 영향 ... 72
• (2) 순환기계, 심혈관계(Cadiovascular System)에 미치는 영향 ... 72
• (3) 호흡기계(Respiratory System)에 미치는 영향 ... 73
• 3.5 비임상 효력시험을 통한 면역원성 및 유효성 평가 ... 90
• 가. Mouse에서의 면역원성 및 유효성 평가 ... 90
• (1) HI assay를 통한 마우스에서의 면역원성 확인 ... 90
• (2) 야생 바이러스 주를 공격 접종한 후 survival rate 확인 ... 91
• (3) 야생 바이러스 주를 공격 접종한 후 마우스 장기 조직에서의 virus titer 확인 ... 92
• 나. Ferret 에서의 면역원성 및 유효성 평가 ... 93
• (1) 야생 바이러스 주를 공격 접종 한 후 임상증상과 체온 변화 확인 ... 93
• (2) HI assay를 통한 페렛에서의 면역원성 확인 ... 94
• (3) 야생 바이러스 주를 공격 접종 한 후 페렛 장기 조직에서의 virus titer 확인 ... 94
• (4) 야생 바이러스 주를 공격 접종 한 후 페렛 lung 조직병리 소견 (H,E 염색) ... 96
• 제4장 연구결과 고찰 및 결론 ... 97
• 제5장 연구성과 ... 99
• 5.1 활용성과 ... 99
• 5.2 활용계획 ... 100
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 101
• 6.1 연구책임자 변경 ... 101
• 6.2 추가 요청 또는 변경 시험 ... 101
• 제7장 참고문헌 ... 102