초록 ▼

1. 연구 목적.
- 신증후 출혈열은 현재 우리 나라를 비롯한 전세계적으로 발병되는 주요 바이러스성 감염성 질환으로 신증후 출혈열의 치료제는 없으며, 백신 접종을 통한 감염의 예방만이 최선의 방책임.
▶새로운 차세대 신증후 출혈열 백신의 필요성;
(1) 현존하는 신증후 출혈열 백신은 한탄바이러스를 포르말린 처리한 사백신으로서 그 면역원성과 안전성에 있어서 논란이 있음.
(2) 따라서 유효성과 안전성이 보장되는 새로운 신증후 출혈열 백신의 개발이 절실히 요구되는 상황임.
(3) 유효성과 안전성을 모두 지닌

1. 연구 목적.
- 신증후 출혈열은 현재 우리 나라를 비롯한 전세계적으로 발병되는 주요 바이러스성 감염성 질환으로 신증후 출혈열의 치료제는 없으며, 백신 접종을 통한 감염의 예방만이 최선의 방책임.
▶새로운 차세대 신증후 출혈열 백신의 필요성;
(1) 현존하는 신증후 출혈열 백신은 한탄바이러스를 포르말린 처리한 사백신으로서 그 면역원성과 안전성에 있어서 논란이 있음.
(2) 따라서 유효성과 안전성이 보장되는 새로운 신증후 출혈열 백신의 개발이 절실히 요구되는 상황임.
(3) 유효성과 안전성을 모두 지닌 차세대 백신을 개발함에 있어서 새로운 분자유전학적 기법을 이용하여 세포성 및 체액성 면역에서 우수한 면역원성과 안전성을 동시에 갖는 새로운 백신용 바이러스주를 개발하고자 함.
2 . 연구내용 및 결과.
(1) 유전자 재편성법을 이용한 무독화(or 약독화) 바이러스의 개발;
1) 신증후 출혈열의 병원체인 한탄바이러스와 비병원성인 프로스펙트힐 바이러스를 실험적으로 동시 감염시켜 생성되는 재편성체를 조사하여 병원성이 없는 바이러스를 얻고자하였다.
① 동시감염의 조건 탐색연구 수행.
② 재편성체 탐색을 위한 multiplex PCR 법 개발 연구.
③ 재편성바이러스 분리 및 분석 연구.
==> 한탄바이러스와 프로스펙트힐 바이러스간의 재편성체를 얻어 이의 유전형을 분석함.
2) 병원성을 쥐 뇌내 증식모델을 이용하여 병원성 여부를 조사함.
① 한탄바이러스 병원성 모델을 이용한 병원성 분석 연구.
==> 생성된 재편성체는 기존의 한탄바이러스와 달리 병원성이 매우 미약함이 확인됨으로서 백신주로의 가능성 확인.
3) 재조합체의 존재 규명.
① super infection을 통하여 얻은 바이러스 중 일부는 두 유전인자간의 recombination 현상이 일어남을 규명함.
(2) 역유전계 방법을 이용한 유전자 재편성 바이러스의 개발;
1) 한탄바이러스의 역 유전계 실험 모델의 개발을 위한 T7 RNA polymerase 발현 세포주 제조.
① T7 RNA polymerase 유전자의 cloning 및 발현형으로 제조.
② Vero E-6 세포주내 로 도입하여 안정발현 세포주 생성 후 발현특성연구.
==> T7 RNA polymerase를 안정발현하는 세포주를 획득함.
2) T7 RNA polsystem을 이용한 바이러스 RNA생성 연구.
① 한탄바이러스 및 프로스펙트힐 바이러스 각 유전체 L, M, S의 cloning.
② 이를 T7 promoter/HDR를 함유하도록 plasmid 구성 후, 이로부터 RNA의 생성 연구.
==> 구성한 플라스미드로부터 바이러스의 유전자와 같은 RNA의 생성을 확인함. 또한 +sense RNA의 생성함.
3) 이후 이 실험계에 프로스펙트힐 바이러스를 감염시키고 한탄바이러스의 SRNA를 transfection을 통하여 전달되도록 하여 이로부터 얻어지는 재조합/재편성체를 검출.
① 재편성/ 재조합체의 생성는 RNA의 polarity에 의존적임을 밝힘.
② 즉 도입 RNA가 negative일 경우 재조합이나 재편성을 이루어지지 않으며, positive sense일 경우만 일어남을 확인.
4) 바이러스 구조 단백질인 Np protein을 발현하는 세포주를 구성하고, 이에 Np 유전자가 deletion된 RNA가 대치되도록 하여 비병원성 유전자 게놈을 갖는 바이러스 제조.
① 한탄바이러스 Np 단백질을 발현할 수 있는 pCMV H5UNp plamid 구성.
② 이를 안정발현 할 수 있는 세포주 구성 => Vero HNp cell line 구성.
③ 이에 deletion되어 있는 HTN S plasmid를 이용하여 deletion 바이러스 제조.
< 연구 결과 >
1. 바이러스 중복감염을 통하여 프로스펙트힐 바이러스의 S segment를 갖는 재편성/재조합 한탄바이러스를 획득하여 이의 병원성을 조사한 결과 프로스펙트힐 바이러스와 같은 비병원성임을 확인하였다.
2. T7 promoter/polymerase system을 이용하여 역유전 system을 확립하였으며, 이로부터 viral/antiviral RNA의 생성 방법을 확립하였다.
3. 유전자 재조합/재편성 바이러스의 생성은 + strand RNA 통한 시도로만 가능함을 밝혔으며, 이는 역유전계 연구에 있어 매우 중심이 되는 기법이 될 것이다.

Abstract ▼

Hantaan (HTN) virus which is major causative agent of HFRS is prototype virus of genus hantavirus established newly in family Buny aviridae.
Be cause there are no effective treatment drugs, vaccines against HFRS, the only applicable methd is control and prevention of the disease. Therefore, devel

Hantaan (HTN) virus which is major causative agent of HFRS is prototype virus of genus hantavirus established newly in family Buny aviridae.
Be cause there are no effective treatment drugs, vaccines against HFRS, the only applicable methd is control and prevention of the disease. Therefore, development of effective vaccine is the most valuable means to control this disease.
We could expect more effective vaccine can be achieved via genetic engineering technology. For the major character of bunyaviruses, Hantaan virus has 3 segmented negative sense single stranded RNA molecules, respectably L, M, S. as genom e. Because of difficulty to treat RNA, genetic engineering technique of this virus has not been achieved until now.
To solve this problem and develope vaccine strain which has effectiveness and safety, we would like to construct two systems; the one is the super infection method and the other is revers genetic system for reassortant hantaan virus.
From HTN and Prospect Hill virus (PHV) super-infected cell and medium, we tried to screen the presence of reassortants or recombinants using multplex PCR. As a result, we could find the reassortant/recombinant viruses in the cell. The pathogenesis of those viruses was tested by inoculation into mouse brain the viruses. From this study, it was evident that those established strains through superinfection are less(or non) pathogenetic phenotypes.
On the other hands, reverse genetic system also constructed for more advanced study.
To server viral or antiviral RNA in the host cell, we constructed T7 RNA polymerase stable cell line derived from Vero E-6, well known host cell line for hantavirus. And all list of viral plasmid was constructed by RT-PCR and cloning. Using this system, PHV was infected into T7 RNA polymerase stable cell line, and plasmid which has hantaan Sgenome as + or - sense was transfected into the cell line subsequently. From this cell line we could detect and isolate recombinant/reassortant viruses which have mixed genome with each other. And also, this recombination and reassortment phenomena occurred only in case of that transfected RNA is positive sense.
We expect th t those establised recombinant/reassortant viruses will offer more diverse chances and be a new candidate for hantaviral vaccine. And also, the methods to obtain recom binant/reassortant virus will offer powerful tools to study viral genetics.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• I. 연구개발결과 요약문 ... 5
• (한글요약문) ... 5
• (영문요약문) ... 7
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 31
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 32
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 37
• 6. 첨부서류 ... 38