초록 ▼

본 연구과제의 목표는 검사가 필요한 현장에서 최종 사용자가 아무런 제약 없이 즉시 검시를 실시하여 결과를 판독할 수 있는 말라리아 진단 키트를 개발하는 것이다. 이를 위하여 제1세부연구개발과제에서는 금 입자(gold particle)와 단세포군 항체(monoclonal antibody)를 결합시켜 test strip을 만드는 방법과 혈구를 탈색시켜 혈구를 제거하지 않고 바로 진단 키트에 혈액 검체를 가하여 결과를 판독하는 방법을 고안하였다. 금 입자는 반응조건에 따라 크기나 모양이 다양하게 제조되는데 환원제의 종류 및 농도, 교반속

본 연구과제의 목표는 검사가 필요한 현장에서 최종 사용자가 아무런 제약 없이 즉시 검시를 실시하여 결과를 판독할 수 있는 말라리아 진단 키트를 개발하는 것이다. 이를 위하여 제1세부연구개발과제에서는 금 입자(gold particle)와 단세포군 항체(monoclonal antibody)를 결합시켜 test strip을 만드는 방법과 혈구를 탈색시켜 혈구를 제거하지 않고 바로 진단 키트에 혈액 검체를 가하여 결과를 판독하는 방법을 고안하였다. 금 입자는 반응조건에 따라 크기나 모양이 다양하게 제조되는데 환원제의 종류 및 농도, 교반속도, 반응온도, 반응시간 등을 조절하여 40nm 크기의 균질한 형태를 갖출 수 있었다. 이 금 입자에 단세포군 항체를 결합시키는 방법도 확립하여 단세포군 항체의 종류에 따라 반응 pH, 첨가량, 교반속도 등이 달라질 수 있다. 단세포군항체와 동물 유래 항체를 이용하여 test strip을 만들어 양성 혈청과 음성혈청을 이용하여 시험하였을 때 일치된 결과를 확인할 수 있었다. 또한 동물유래 항체에 의한 비특이 반응을 제거하기 위하여 동물유래 항체 대신 말라리아 치료제인 클로로퀸의 secondary amine과 소 혈청 알부민의 primary amine을 heterobifunctional linker (N-Succinimidyl iodoacetate)를 이용하여 결합시킨 후 strip 제조에 사용하였다. 혈청을 사용하는 면역크로마토그래피 (immunochromatographic assay, ICA) 키트의 단점을 극복하기 위하여 혈액을 전처리 과정을 통하여 탈색시키는 방법을 고안하였는데 전처리 용액은 1.5% H2O2 0.016%Sag471, 0.003% NaN3 및 5mM EDTA를 포함하는 인산염완충액 (phosphate-buffered saline, PBS)으로 구성된다. 이때 과산화수소는 탈색제, Sag471은 과산화수소가 물과 산소로 분해되면서 발생하는 거품을 제거하기 위한 거품억제제, 아지드화 나트륨은 이러한 분해작용을 촉매하는 카탈레이즈(catalase)에 대한 효소저해제, EDTA는 heme으로부터 떨어져 나온 Fe 이온과 착화물을 형성하여 결과적으로 탈색을 촉진시키는 chelating agent 등으로 작용한다. 전처리 용액으로 혈액을 탈색시킬 때에는 전처리 용액의 부피에 대하여 약 20%까지의 혈액량에서도 효과가 있었는데 과산화수소의 함량을 높여 더많은 양의 혈액을 탈색시킬 수 있다.

Abstract ▼

To accomplish this, we divided it into two sub-projects. In the first one, we manufactured test strips by utilizing the conjugate of monoclonal antibody and gold particles and design the method which could be read the test result after adding blood sample into the test kit without centrifuging the b

To accomplish this, we divided it into two sub-projects. In the first one, we manufactured test strips by utilizing the conjugate of monoclonal antibody and gold particles and design the method which could be read the test result after adding blood sample into the test kit without centrifuging the blood to get rid of the blood cells. The size and shape of gold particles is dependent on the reaction condition. We could produce the uniform-shaped gold particles of 40 nm size by adjusting the kind of reductant, stirring speed, temperature, and reaction time. We also established the method to conjugate the proteins to gold particles. The conjugation condition (pH, kind and amount of reducing agent, kind and amount of protein, stirring speed) was varied according to the kind of monoclonal antibodies. We could confirmed that the result of the tests were the same to that of ELISA test when the test was performed on the respective strip made of monoclonal antibody and animal anti-malaria by adding the positive or the negative sera.
The chloroquine was used to remove the non-specific binding due to the animal antisera. It was used after conjugated to the bovine albumin (BSA). The heterobifunctional linker (N-Succinimidyl iodoacetate) was connected the secondary amine of chloroquine to the primary amine of BSA. This assay strip has to be tested with serum like the most of any others because, so far, the whole blood is not applicable to the ICA kit due to the visual hindrance by its own color of the red blood cells. Thus, in order to perform ICA with the whole blood, it is necessary to take some steps (coagulation and centrifugation) to prepare serum from the whole blood collected, which may require certain equipments and extra laboratory expenses. We designed to apply the sample to a sample well of an ICA kit after getting rid of the hindrance by pretreatment and decolorization of blood cells to overcome this problem and the pretreatment solution was composed of 1.5% hydrogen peroxide (), 0.016% Sag 471, 0.003% sodium azide() and 5 mM EDTA in PBS. plays a role of decoloring agent, Sag 471 does antifoam to restrain the mixture from foaming originating from oxygen() which is one of decomposition products of , does enzyme inhibitor against catalase which expedites decomposition reaction, and EDTA does chelating agent which facilitate decoloring reaction by chelating with Fe ion released from heme. The blood was effectively decolorated when adding volume of blood sample was below 20% in regard to that of the pretreatment solution. The percentage could be increased by raising the concentration of hydrogen peroxide. In the second one, the various recombinant antigens of Plasmodium which was the causative parasite of malaria was prepared and injected intraperitoneally to female Balb/C mice and boosted 3 times. The spleen cells of the mice were hybridized with mouse myeloma cell line SP2/0-Ag14 according to a modification of the original method. Cultured hybridoma cells were inoculated into the peritoneal cavity of the mice and the ascitic fluids were collected after 10 to 14 days. The fluid were purified by applying to a protein A-Sepharose column and the monoclonal antibodies against the respective recombinant antigens were utilized as tracer antibody on the test strip. In the meanwhile, the antigens were injected intraperitoneally to female rabbits and boosted 3 times. The blood were collected after 30 days and the rabbit anti-malaria were purified in the same method to the monoclonal antibody. The purified rabbit anti-malaria antibody was used as capture antibody.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• I. 연구개발결과 요약문 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 4
• Project Summary ... 6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 10
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 19
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 24
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 25
• 6. 첨부서류 ... 26
• III. 제1세부연구개발과제 연구결과:현장에서 사용 가능한 말라리아 진단 키트의 개발 ... 28
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 29
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 30
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 32
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 33
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 35
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 36
• 7. 참고문헌 ... 37
• IV. 제2세부연구개발과제 연구결과:P.falciparum 및 P.vivax의 주요 항원 component에 대한 단세포군 항체의 개발 ... 38
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 40
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 41
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 43
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 52
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 53