초록 ▼

본 과제는 미생물유래 Astaxanthin을 함유하는 항산화성 식품첨가제 개발 및 Astaxanthin의 새로운 기능성 탐색을 목적으로 수행되었다.
이러한 목적을 달성하기 위하여 3개 세부과제에서 다음의 실험을 수행하였다: 1) 효모 Xanthophyllomyces dendrorhous의 대량 생산체계 확립 (30톤-100톤), 2) 효모로부터 astaxanthin의 고농도 고순도 추출, 3) 추출된 Astaxanthin의 식품첨가물 형태로의 가공, 4)개발된 식품첨가물의 안정성 및 유통기간 규격 등 확립, 5) 감마선 조사에

본 과제는 미생물유래 Astaxanthin을 함유하는 항산화성 식품첨가제 개발 및 Astaxanthin의 새로운 기능성 탐색을 목적으로 수행되었다.
이러한 목적을 달성하기 위하여 3개 세부과제에서 다음의 실험을 수행하였다: 1) 효모 Xanthophyllomyces dendrorhous의 대량 생산체계 확립 (30톤-100톤), 2) 효모로부터 astaxanthin의 고농도 고순도 추출, 3) 추출된 Astaxanthin의 식품첨가물 형태로의 가공, 4)개발된 식품첨가물의 안정성 및 유통기간 규격 등 확립, 5) 감마선 조사에 의해 생성되는 oxygen radical에 의한 효모 X. dendrorhous의 사멸율 측정 및 mutagenesis 조건 확립, 6) Astaxanthin 생산능 증진 균주의 screening 방법 개발, 7) 감마선 mutagenesis에 의한 Astaxanthin overproducing mutant 선정, 8) 선정된 mutant의 최적 배양 조건 확립, 9) 선정된 mutant를 이용 산업적 대량 생산을 위한 scale-up 기술 연구, 10) Oxygen radical과 Astaxanthin overproducing 기작과의 상관관계 연구, 11) 동물 급여에 의한 항산화성 효소의 level 측정, 12) 동물 급여에 따르는 독성검사, 13) 항산화제의 일반적 성질인 동맥경화예방 등의 효과 검정, 14) 중성지질, cholestrol 등의 혈청내 level 조사를 통한 새로운 기능성 탐색.
위에서 열거한 실험을 수행한 결과 성공적으로 목적한 astaxanthin 함유 기능성 식품소재를 개발하였다. 세부적인 결과를 살펴보면 다음과 같다. X.dendrorhous의 대량 생산 (30ton)을 통한 대량의 Astaxanthin 확보 및 추출물 제조하였다. 추출의 방법은 생물학적, 화학적, 물리적 추출 중 물리적 추출이 가장 효과적으로 판단되었다. 효모의 건조 방법은 Drum dryer와 Spray dryer를 사용하였을 때 Drum dryer는 Spray dryer에 비해 추출율이 높고 가격이 싸지만 Astaxanthin 의 파괴가 50%이상이어서 사용하기 곤란하였다. 따라서 Spray drying 후 물리적 처리 방식이 최적으로 결정되었다. 효모의 astaxanthin이 동물에의 이용 효율을 조사한 결과 Drum drying 된 효모는 직접 사용이 가능 (물리적 처리 없이)하였다. 또한 Astaxanthin을 이용한 닭 사육은 닭의 육질 향상을 기대할 수 있었다 (Antioxidant effect). 기능성 소재로 사용하기 위하여 astaxanthin 추출물을 시험한 결과 astaxanthin의 hydrophobicity 때문에 음료형 기능성 식품 제조가 힘들지만 Capsule형으로는 제조가 가능하였다. 이의 보관 기간 중 Astaxanthin의 파괴가 지속적으로 일어나며 15주후에는 약 10% 정고가 파괴되었다. 따라서 저온 저장으로 4개월 정도의 유효기간이 적당하였으며 저장기간 중 미생물에 의한 변패는 별 문제 없었다.
효모로부터 항산화능 함유 고부가가치 식품 첨가물 소재인 Astaxanthin 생산능력 증진을 위하여 감마선 조사를 이용 새 균주를 제조하였다. 본 실험에서 사용된 균주는 wild-type인 UCD-FST 67-385와 이의 Astaxanthin hyper-producing mutant로 알려진 2A2N(antimycin-NTG induced mutant)을 선정하여 감마선 조사를 통해 선정된 mutant 3A4-8은 모균주보다 Carotenoid를 69 % 더 생성하였다. YM broth내의 탄소원과 질소원을 달리하여 Carotenoid 색소 함량과 균주의 성장에 미치는 영향을 알아보았다. Carotenoid 색소 함량은 cellobiose와 peptone이 탄소와 질소원으로서 가장 우수하였다. 그러나 glucose에 비하여 cellobiose는 10배 이상의 가격차이가 나므로 대량 생산 시 비용을 고려하여 최종적으로 glucose와 peptone이 적당하다고 사료된다. 산업화를 위한 scale-up 연구로서 jar fermenter를 이용하여 배양한 결과 배양 7일째 carotenoid 함량이 가장 높았으며 flask 배양보다 높은 함량의 Carotenoid를 얻을 수 있었다. 또한 모균주인 2A2N과 2차 감마선 조사를 통해 최종 선정된 3A 4-8의 단백질체 분석을 2-D gel electrophoresis를 실시한 결과 300여개의 spot이 관찰 되었고 모균주와 mutant 간의 다른 pattern을 보이는 18개의 spot을 확인하였다.
Astaxanthin 함유 식품의 동물 급여에 따르는 독성검사결과 시험기간중 사망동물은 없었으며 전 투여군에서 특이 할 만한 임상증상이 관찰되지 않았다. 체중변화 및 사료 섭취 변화량 역시 대조군과 비교하여 암ㆍ수 전 투여군에서 유의차가 관찰되지 않았다. 또한 부검시의 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사결과 대조군에 비해 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
Hypoxanthine (guanine) phosphoribosyl transferase gene(hprt) gene의 mutation frequency, 염색체이상시험, 말초혈액내의 망상적혈구(reticulocyte)에서 비정상적인 염색체 성분인 소핵을 형광 염색하여 관찰한 결과를 시험군에서 통계적 유의성이 관찰되지 않았다.
이상의 결과를 종합하면, 본 실험 조건 하에서는 Astaxanthin 함유 식품의 동물 급여는 유전독성을 유도하지 않음을 알 수 있었다. 동물 급여에 의한 항산화성 효소의 level 측정을 위해 Apoe knock out mice를 이용해서 Nrf-2, Cu-Zn SOD, Mn SOD, Catalase, GPX, GSH 등의 항산화 효소 활성에 미치는 효능을 in vivo 모델을 이용하여 검정한 결과 Nrf-2, Cu-Zn SOD, GPX, GSH등의 변화를 관찰할 수 있었다. 각종 질병과 노화의 원인이 되는 활성산소를 제거하여 노화방지 및 면역을 높여 준다는 것이 확인 된 항산화 효소 활성에 미치는 효능의 검증에 대한 추가적인 실험이 필요하다고 생각된다. 현재 Nrf-2에 영향을 주는 MEK, ERK등과 같은 상위 pathway의 연구와 mRNA level에 변화가 있는 Cu-Zn SOD, GPX등의 protein level의 변화를 실험하고 있다. 또한 Apoe knock out mice를 이용해서 중성지질, cholesterol 등의 혈청내 level을 측정한 결과 cholesterol의 감소를 관찰할 수 있었다. 따라서 Astaxanthin 함유 식품첨가물은 혈중에 콜레스테롤이나 중성지방이 많아져 생기는 동맥경화나 관상동맥 심장질환 같은 고지혈증에 효과를 나타낼 것으로 보인다.
결론적으로 본 과제에서는 1) 효모 X. dendrorhous의 대량생산 및 Astaxanthin의 성공적 추출을 통한 기능성 식품소재 개발, 2) 효모의 효율성 증대를 위한 Astaxanthin 함량이 증대된 X. dendrorhous의 균주개량, 3) Astaxanthin의 콜레스테롤 저하 효과 및 일부 항산화 효소의 발현증대를 보았다. 따라서 효모로부터 유래된 Astaxanthin은 기능성식품의 소재로 사용될 수 있도록 개발 되었다.

Abstract ▼

This project pursued to development of an antioxidant food additive containing astaxanthin and to find a unknown function of it.
To achieve the goal of this project, the following experiments were performed in 3 sub-teams: 1) mass production of the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous(30 tons), 2

This project pursued to development of an antioxidant food additive containing astaxanthin and to find a unknown function of it.
To achieve the goal of this project, the following experiments were performed in 3 sub-teams: 1) mass production of the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous(30 tons), 2) highly concentrated and pure astaxanthin extraction from the yeast, 3) processing of the extracts as a food additive, 4) setting of the shelf life of the developed food additive, 5) measurement of death rate of X. dendrorhous by the oxygen radical produced by γ-radiation and setting up conditions for mutagenesis, 6) development of screening method to select an improved mutant, 7) selecting astaxanthin overproducing mutants by -radiation, 8) setting up culturing conditions for selected mutants, 9) scaling-up for the mutants, 10) studying relationship between oxygen radical and astaxanthin overproduction, 11) measuring antioxidant enzymatic level in animal after feeding of the food additive, 12) determining toxicological effect to animal, 13) testing of sclerosis prevention by antioxidant effectof astaxanthin, and 14) finding unknown functions of astaxanthin related with the levels of cholesterol and triglycerides in blood.
By performing the experiments listed above, the functional food component containing astaxanthin was successfully developed. The detailed results are described in the following sentences. X. dendrorhous was produced at an industrial level (30 tons) and a large amount of astaxanthin was achieved. There are chemical, physical, and biological methods degrading the cell wall of X. dendrorhousand the physical method was most effective. Two drying methods were available; drum drying and spray drying. Drum drying was cheap and easy to extract astaxanthinbut pulled down >50% of astaxanthin, compared to spray drying.
Therefore, X. dendrorhous was set to be dried by a spray dryer and processed by the physical method. Interestingly, the high extractability of astaxanthin made it possible to use the yeast without the physical process. The use of the yeast as feed additive to chickens improved the quality of meat by antioxidant effect. The hydrophobic characteristic made impossible to use in drinking style but it can be used as a capsule form. About 10% of the astaxanthin in capsules were destroyed after 15 wk. Therefore, the capsules were safely kept for 4 months at 4C. During storage, there was no problem related with microorganisms.
We made new strains by using -radiation for overproduction of astaxanthin which is antioxidation ability inclusion high added value food additive material from yeast. Created more Carotenoid 69% more than 2A2N mother strain that strain used in this experiment is known as UCD-FST 67-385 and astaxanthin hyper-producing mutant of two that is will-type. Differ carbon source fare and nitrogen source in YM broth and searched Carotenoid pigment content and effect getting in growth of strain.
Carotenoid pigment content were the most superior as carbon and nitrogen source cellobiose and peptone. But, is thought that cellobiose considers expense when mass-produce because price variance more than 10 times becomes than glucose and glucose and peptone are suitable finally.
As scale-up study for industrialization, could carotenoid content had been the highest for wave and cultivation 7 day which cultivate using jar fermenter and gets Carotenoid of High content than flask cultivation. Also, protein sieve analysis of 3A 4-8 that is elect finally through 2A2N and the second gamma irradiation that is mother strain wave and 300 that 2 - D gel electrophoresis spot of dogs was observed and confirmed 18 spots that is shown other pattern between parent strain and mutant .
There was no death animal between toxicity examination wave and testingperiod for animal allowance of astaxanthin inclusion food and presence at a sickbed symptoms worth being singular in the all medication militaries were not observed. Cancer because compare weight change and the food intake change amount with control group. Significant difference was not observed in the number all medication militaries. Also, change that is some than blood school register examination at postmortem examination, blood business school register examination wave and control group was not observed. Result that observe acinus that is absurd chromosome ingredient in Hypoxanthine (guanine) phosphoribosyl transferase gene (hprt) gene's mutation frequency, chromosomal aberration examination, reticulocyte(reticulocyte) in tip of a twig blood dying fluorescence in experimental military statistical significance observe.
If synthesize result of above, could know that animal allowance of astaxanthin inclusion food does not motive genetic toxicity under seeing experimental condition. Could observe change of Nrf-2, Cu-Zn SOD, Mn SOD, Catalase, GPX, wave and Nrf-2 that authorize effect on antioxidase vitality of GSH etc.. utilizing in vivo model, Cu-Zn SOD, GPX, GSH etc. to use Apoe knock out mice for level measurement of enzyme for antioxidation by animal allowance.
Is thought that need additional experiment about verification of effect that get in antioxidase vitality that it is confirmed that remove active oxygen that is responsible for various diseases and aging and raise antiageing and immunity. Is experimenting protein level's change of Cu-Zn SOD, GPX etc.. that change is in MEK, high position pathway's study such as ERK etc.. and mRNA level influencing to present Nrf-2. Also, could observe decrease of wave and cholesterol that measure neuter gender nature of soil, serum inside level of cholesterol etc.. to use Apoe knock out mice. Therefore, because astaxanthin inclusion food additive becomes much cholesterol or neutral fat during hole, is expected to operate in resulted hardening of the arteries or hyperlipemia such as coronary arteries cardiac disorder.
Conclusively, in this project, the followings were achieved: 1) the development of functional food additive by the mass production of X. dendrorhous and successful extraction of astaxanthin, 2) the strain improvement of X. dendrorhous to improve productivity of astaxanthin, and 3) increased expression of several antioxidant enzymes and decreased cholesterolin blood by astaxanthin. Therefore, astaxanthin from the yeast was developed to be used as a component of an functional food.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 6
• Project Summery ... 8
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 14
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 39
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 41
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 43
• 6. 첨부서류 ... 43
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 44
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 45
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 46
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 50
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 76
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 77
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 78
• 7. 참고문헌 ... 79
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 80
• 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 81
• 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 83
• 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 87
• 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 96
• 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 98
• 6. 제 2 세부연구개발과제의 활용계획 ... 99
• 7. 참고문헌 ... 100
• 제 3세부연구개발과제 연구결과 ... 103
• 1. 제 3세부 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 104
• 2. 제 3세부 연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 105
• 3. 제 3세부 연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 108
• 4. 제 3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 116
• 5. 제 3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 117
• 6. 제 2세부연구개발과제의 활용계획 ... 118
• 7. 참고문헌 ... 119