초록 ▼

연구개발사업의 목적: 인체의 간세포암종은 다단계의 발생과정을 거쳐 발생되며, 전암병변으로서 이형성 결절이 중요하다. 틸로머라제 활성화 및 틸로미어 길이 감소 현상은 암세포 발생기전에 매우 중요한 역할을 한다. 정상세포는 틸로머라제 활성이 음성인데 반해, 암세포는 높은 틸로머라제 활성도를 나타내며 틸로미어 길이를 유지시킨다. 그러므로 틸로머라제 활성도 억제 기전이해는 항암제 개발에 필수적이라 할 수 있다. 최근 간세포암종에서 암억제 유전자가 있을 만한 위치로 유력한 8p23에 위치한 PinX 1가 과발현되면 틸로머라제 활성도를 억제함

연구개발사업의 목적: 인체의 간세포암종은 다단계의 발생과정을 거쳐 발생되며, 전암병변으로서 이형성 결절이 중요하다. 틸로머라제 활성화 및 틸로미어 길이 감소 현상은 암세포 발생기전에 매우 중요한 역할을 한다. 정상세포는 틸로머라제 활성이 음성인데 반해, 암세포는 높은 틸로머라제 활성도를 나타내며 틸로미어 길이를 유지시킨다. 그러므로 틸로머라제 활성도 억제 기전이해는 항암제 개발에 필수적이라 할 수 있다. 최근 간세포암종에서 암억제 유전자가 있을 만한 위치로 유력한 8p23에 위치한 PinX 1가 과발현되면 틸로머라제 활성도를 억제함이 보고되었다. 인체의 간암발생과정에서 틸로머라제 활성화와 억제의 기전을 규명하기 위해 다음과 같은 연구를 수행하였다.
연구방법: 효소의 주요요소인 hTERT 단백질이 틸로머라제 활성도를 결정하므로 이 유전자 발현 기전이해는 틸로머라제 활성도 기전이해를 위해 필수적이다. 이를 위해 만성 간염, 간경변증, 거대재생결절, 이형성결절 저등도, 이형성결절 고등도, 간세포암종 및 정상 간조직에서 각 병변의 hTERT m RNA 발현양과 hTERT 유전자수를 비교분석하였다. 틸로머라제 활성도 방해제로 알려진 PinX 1 발현양과 틸로머라제 활성도 변이 및 틸로미어 길이와의 관계를 인체의 간세포암종에서 분석하였다. hTERT 및 hPinX 1 m RNA 발현양과 hTERT 유전자수는 real-time quantitative RT-PCR 또는 PCR을 이용하여 측정하였고, 틸로머라제 활성도는 TRAP assay, 틸로미어 길이는 Southern blot을 이용하였다. 성인 간에서도 발견되는 간 기간세포 (stem cell)는 간암 발생과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 간 기간세포와 유사한 성질을 가지고 있는 쥐 상피세포를 지속적으로 배양하며 이들의 생물학적 변화와 틸로머라제 활성도 변이, 틸로미어 길이변이를 분석하고 이들과 세포변형과의 관계를 비교분석하였다.
연구결과:
거대 재생결절은 만성간염 및 간경변증과 비슷한 수준의 틸로머라제 활성도를 보였다. 이형성결절 저등도는 비교적 광범위한 범위의 틸로머라제 활성도를 보였으며, 이형성결절 저등도의 23% 는 이형성결절 고등도에 상응하는 틸로머라제 활성도의 증가를 보였다. 이형성결절 고등도와 HCC가 발생된 이형성결절은 모두 HCC 에 버금가는 틸로머라제의 활성도를 보였다. 이러한 다단계 간암발생과정에서의 틸로머라제의 활성화는 다중심성 발생을 보인 환자의 결절들에서 뚜렷하였다. 인체의 다단계 간암발생 과정에서 틸로머라제의 재활성화는 간암 발생의 조기 과정인 이형성 결절 단계에서 발생되며, 만성 간염/간경변증 환자에서 전암 및 암종 병변을 조기에 진단할 수 있는 유용한 지표로 생각한다. 이형성 결절은 고등도 뿐만 아니라 저등도의 이형성결절도 아직 조직학적 이형성의 정도는 미약하나 전암병변의 생물학적 특성을 획득한 것으로 생각한다.
인체의 다단계 간암발생 과정에서 hTERT m RNA 발현의 증가는 간암 발생의 조기 과정인 이형성 결절 단계에서 발생되며, hTERT m RNA 발현양이 증가함에 따라 틸로머라제 활성도도 증가되었다. hTERT m RNA 는 틸로머라제 활성도와 함께 만성 간염/간경변증 환자에서 전암 병변 및 간세포암종 병변을 조기에 진단할 수 있는 유용한 지표로 생각한다.
hTERT 유전자수는 주변 간조직과 비교 했을때 크게 변화되지 않았으며, hTERT 유전자수와 hTERT m RNA 발현양는 상관관계가 없었다. 간암발생과정에서 틸로머라제 활성화는 hTERT 유전자수 변이에 기인되지 않는 것으로 추정된다.
간암발생과정에서 틸로머레이즈 활성 및 틸로미어 길이조절 인자로서 hPinX1에 대하여 연구한 결과 hPinX1가 틸로미어 길이조절에 관여함을 밝혔으며, 틸로머레이즈 활성조절에는 직접적으로 관여하지 않았다.
간 기간세포와 유사한 성질을 가지고 있는 쥐 상피세포인 LE/2, LE/6, WB-F 344는 모두 140 passage까지 노화성질 없이 초기 계대세포와 유사한 생물학적 성질을 유지하였다. 오랜 시간의 계대배양과정동안 LE 세포는 변형되지 않은 반면, WB-F 344 세포는 passage 50대부터 transform 되었다. 틸로머라제 활성도와 틸로미어 길이는 계대배양에 따라 점차적으로 감소하였으나 말기 계대에서는 틸로머라제 활성도가 증가하면서 틸로미어 길이도 유지되었다. 이는 틸로머라제 활성도가 틸로미어 길이조절에 관여함을 시사한다.
기대효과:
∙전암병변을 비롯한 인체의 다단계 간암발생과정의 각 단계의 병변에서 telom erase 활성도와 중요한 구성성분인 hTERT m RNA의 발현 정도는 간의 결절성 병변에서 경계영역성 병변(전암병변)및 간세포암종의 조기 진단법 개발에 활용 가능함.
∙다단계 간암발생 과정에서 hPinX 1에 의한 telomere 길이 조절기전은 간암종 발생 억제 및 항암치료제 개발에 활용 가능성이 있음.

Abstract ▼

Backgrounds/Aims : The main tenance of telomere with telom erase reactivation, vital for corcinogenesis, was studied in human multistep hepatocare inogenesis for the characterization of borderline lesions. PinX 1 is located at 8p23, a region with frequent loss of heterozyogsity in hepatocellular car

Backgrounds/Aims : The main tenance of telomere with telom erase reactivation, vital for corcinogenesis, was studied in human multistep hepatocare inogenesis for the characterization of borderline lesions. PinX 1 is located at 8p23, a region with frequent loss of heterozyogsity in hepatocellular carcinom as (HCCs). Overexpression of PinX 1 is known to inhibit telom erase activity, shorten telom eres and induce crisis while its depletion increases tum origenesis in nude mice. These results suggest that PinX 1 might be critical for hepatocarc inogenesis.
Methods and Results: The telom erase activity (TA) and TERTm RNA were exam ined in 3 chronic hepatitis (CH), 10 cirrosis, 7 large regenerative nodules (LRNs), 30 low grade dysplastic nodules (LGDNs), 6 high grade DNs (HGENs), 3 DNs with HCC foci, 11 HCCs, and 4 normal livers by TRA Peze E lisa telom erase detection and real time RT-PCR. The TA showed sign ificant differences between the LGDNs and HGDNs. Most LGDNs had similar levels of TA to those of the CH, cirrhosis and LRNs, how ever 7% of LGDNs showed high levels of TA. The levels of TA in HGDNs showed no significant differences from those of DNs with HCC foci and HCCs. The expression of TERT m RNA was similar to that of TA.
We assessed transcript expression of PinX 1, the correlation between PinX1 m RNA level and telomere length and telom erase activity, as well as sequence alteration, in 24 HCCs and their adjacent non-HCC tissues form patients wiht B viral chronic hepatitis/cirhosis. There was no significant difference between the levels of PinX 1 m RNA in HCCs and those in non-HCCs. The PinX1 m RNA tended to increase as the telomere shortened in the HCCs(p=0.067, R2=0.166), but no correlation was found in non-HCCs. The PinX 1 level revealed no significant relation ship with telom erase activity in HCCs non-HCCs. The missensem utations of PinX, at the 250 and 264 residues, were found in 17% of the HCCs and their adjacent non-HCCs. The mutations were located in the non-conserved region and revealed no relation with PinX 1 expression, telomere length and telom erase activity, suggesting that they are lkely polym orphisms.
Rat hepatic stem-like epithelial cells, LE/2, LE/6 and WB-F344, sharea number of phenotypic properties with oval cells, observed in the early stages of hepatocarcinog enesis. we describe regulations of telom erase and telomere length during in vitro aging of LEs and WB-F 344. These cells displayed no apparent aging phenotypes for over 140 passages.
Telom erase activity and telomere length of these cells prog ressively decreased with the passages, and at the late passages, telomere shortening appeared to be reduced as telom erase activity increased. Regulation of TERT and TR , key com ponents of telom erase, was similar to that of the telom erase activity. LE spossessed weak telom erase activity with a slow rate of proliferation com pared to WB-F 344, and were not tumorigenic, whereas WB-F 344 was transform ed in vitro from interm ediate passage.
Conclusions : The reactivation of telom erase and increase of TERT m RNA occur in the DNs during the early stages of hepatocarcinogenesis, with a significant change in the transition of LGDNs to HGDNs. The characteristics of HGDNs are considered to be closer to those of HCCs.
PinX 1 may not play a major role in hepatocarcinog enesis as a targ ettum or suppressor gene located at 8p23. PinX 1, how ever, might be involved in the telom ere length regulation of HCCs.
LEs and WB-F 344 have different biochem ical properties, and telom erase activation and short telom eres are unlikely necessary for the transform ation of WB-F 344. TERT and TR seem to be the regulators of the telom erase activity. The relationship betw een telom ere length and telom erase activity sug gests that telom erase contributes to the reg ulation of telom ere leng thin these cells. Our findings would provide a better understanding of mechanism sinneoplastic transform ation of rat hepatic stem-like epithelial cells.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 22
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획 ... 23
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 23
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 32
• 7. 첨부서류 ... 32