근조직 적합형 단백질은 Clostridium botulinum 속 세균이 생산하는 단백질 복합체로서 신경질환 관련분야의 치료제로서 응용되어지고 있으며 국내에서는 주름살제거를 목적으로 많이 사용되어지고 있다. 또한 근조직 적합형 단백질은 신경질환관련 분야로의 응용분야를 넓혀가고 있는 실정으로 국내에서는 이를 대체할 소재의 개발이 절실하다. 근조직 적합형 단백질은 근긴장이상(Dystonia), 떨림(Tremor), 강직(Spasticity), 위소장(Gastrointestinal), 피부(Dermatologic), 수근경련(Muscle
근조직 적합형 단백질은 Clostridium botulinum 속 세균이 생산하는 단백질 복합체로서 신경질환 관련분야의 치료제로서 응용되어지고 있으며 국내에서는 주름살제거를 목적으로 많이 사용되어지고 있다. 또한 근조직 적합형 단백질은 신경질환관련 분야로의 응용분야를 넓혀가고 있는 실정으로 국내에서는 이를 대체할 소재의 개발이 절실하다. 근조직 적합형 단백질은 근긴장이상(Dystonia), 떨림(Tremor), 강직(Spasticity), 위소장(Gastrointestinal), 피부(Dermatologic), 수근경련(Muscle), 근경련(Myoclonus), 뇌성마비(Cerebral palsy), 안과(Ophthalmology), 생식비뇨기(Genitourinary) 및 통증(Pain)의 완화 및 치료에 효과적으로 응용되어지고 있다. 본 연구과제의 수행을 통하여 근조직 적합형 단백질의 최적 분리 공정을 개발하고, 근조직 적합형 단백질의 전달체계의 최적화를 위한 제형을 개발하여 주사제 및 DDD(Drug Delivery System)의 개념을 도입하기 위한 제형을 개발하고자 하였다. 또한 단백질의 대량 생산 공정을 개발하기 위한 최적 배지의 조성, 최적 성장조건의 확립 및 생산성 극대화를 위한 생산 공정의 확립하기 위한 연구를 진행하였다. 한편 동물실험을 통한 효능을 검색하기 위하여 효능검색, 단백질의 정확한 활성측정, 인체 적정 투여량의 확인, 독소 단백질의 안정성 및 안전성의 확보를 위한 연구를 진행하였다. 연구에 사용되어진 근조직 적합형 단백질의 생산균주는 형태학적, 생화학적 특성을 관찰한 결과 Clostridium botulinum Type A 균주와 동일한 특성을 나타내었으며, 16s rRNA, 아미노산 서열분석 및 heavy chain 및 light chain의 염기서열을 확인하여 본 결과 type 균주임을 확인하였다. 근조직 적합형 단백질의 분리 및 정제는 산침전과 이온교환수지 크로마토그라피를 이용하였으며 단백질의 결정화는 이온교환수지 크로마토그라피를 통하여 얻어진 분획의 저온보관 및 해동함으로서 순수한 단백질의 결정을 획득할 수 있었다. 결정화로 정제되어진 근조직 적합형 단백질은 실험동물을 이용한 효능의 검색을 통하여 2.4 x 108 /ml의 활성을 나타내었으며, 기존의 제품과 비교하여 동일 수준의 활성을 나타내었다. 근조직 적합형 단백질의 제품화에 있어 요구되어지는 안정성을 확보하기 위한 실험에서 BSA 또는 HSA의 첨가가 필수적이며, pH를 6.0이하로 조정함으로서 안정성을 확보할 수 있었다. 또한 trehalose의 첨가가 온도에 따른 변화에 안정적으로 독소 단백질의 활성을 유지하는데 중요한 인자임을 확인하였다.
Abstract▼
Botulinum toxin preparations can provide patients with a therapeutic modality that may improve both their medical condition and quality of life. The mechanism of action of the various botulinum toxin preparations and serotypes is similar: they all block neurotrans mitter release. The majority of cli
Botulinum toxin preparations can provide patients with a therapeutic modality that may improve both their medical condition and quality of life. The mechanism of action of the various botulinum toxin preparations and serotypes is similar: they all block neurotrans mitter release. The majority of clinical conditions treated are based upon the targeted temporary chemodenervation of the selected organ. The antinociceptive effects of botulinum toxin type A, based on preclinical studies and clinical experiences in treating movement disorders and other painful conditions, will also be studied to how this compound may act as it alleviates the discomfort associated with various conditions. Chronic therapies with preparations with the lowest amount of neurotoxin protein provide the best chance for long-term therapy by minimizing the potential of the patient to form neutralizing antibodies. Differences in formulations or serotypes impart unique efficacy and safety profiles and thus does not support a simple dose ratio conversion between products. The microbial strain has been isolated and purified from liquid culture. The screened strain is defined as Clostridium botulinum type A strain by 16S rRNA sequencing, compare of N-terminal amino acid sequence of crysallized toxin protein and 150 kDa of neurotoxin(composed heavy and loghy chain). The toxin is homogenuous by acid precipitation, ionexchange chromatography, gel filtration and crystallization. The specific toxicity of purified is 2 x 108(LD50)/ml , the molecular weight is 900 kDa by SDS-PAGE. Botulinum toxin for medical use is diluted to very low concentration(ng/ml); when it is preserved by lyophilization, considerable loss of activity can occur. In this study, condition that gave〉90% recovery of the toxicity after lyophilization of solutions containing 20 to 1,000 mouse 50 % LD50/ml were found. Toxicity was recovered upon drying 0.1 ml of toxin solution when the pH was maintained below 7 and bovine and human serum albumin were used as stabilizers. Various other substances tyested with albumin, including glucose, sucrose, trehalose. mannitol, glycin and cellibiose, did not increase recovery on drying.
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