초록 ▼

본 B형 보툴리눔 독소주사제의 신약으로의 개발 과제는 총 3년간 3개의 세부기관으로 나뉘어 연구릉 진행하고 있으며, 최종 연구개발 목표는 B형 보툴리눔 독소 주사제의 제품화 완료, 주사제 시제품 생산 및 이를 이용한 전임상 시험 완료이며, B형 보툴리눔 주사제의 새로운 임상적응증 (통증치료용)연구를 목표로 진행해가고 있다.
제1, 제2세부 과제에선 주사제용 B형 독소단백질 생산을 위한 최적배양법과 DEAE
Sephadex A-50 크로마토그래피법을 이용한 순수분리 정제법을 확립하였다. 또한 APTG 크로마토그래피법을 확립

본 B형 보툴리눔 독소주사제의 신약으로의 개발 과제는 총 3년간 3개의 세부기관으로 나뉘어 연구릉 진행하고 있으며, 최종 연구개발 목표는 B형 보툴리눔 독소 주사제의 제품화 완료, 주사제 시제품 생산 및 이를 이용한 전임상 시험 완료이며, B형 보툴리눔 주사제의 새로운 임상적응증 (통증치료용)연구를 목표로 진행해가고 있다.
제1, 제2세부 과제에선 주사제용 B형 독소단백질 생산을 위한 최적배양법과 DEAE
Sephadex A-50 크로마토그래피법을 이용한 순수분리 정제법을 확립하였다. 또한 APTG 크로마토그래피법을 확립하여 분리된 독소단백질 분획에서 비독성 단위체를 제거한 순수 독소단백질만을 회수하여, 각각 분리된 독소단백질간의 특이역가를 비교 분석하였다. 분리된 보툴리눔독소의 정성 및 정량 분석을 위해 SDS一PAGE에 의한 독소 단백질 조성 확인과 B형 독소 특이적 단일클론항체를 이용한 ELISA 방법 및 Westem Blot 분석을 실시하였고, 독소단백질의 특이역가 계산법 확립을 위해 마우스를 이용한 복강투여법으로 반수치사량을 산술적으로 구하여 분석을 실시하였다.
주사제 개발을 위한 고특이역가 독소 원료를 개발하기 위한 첫째 방법으로, 독소단백질의 단편을 E. coli에서 재조합하여 대량발현 및 분리정제를 통해 준비하고, 원하는 부위만 포함하는 생체외 폴딩 연구를 위한 재료를 마련하였다. 둘째방법은 정제된 독소단백질을 단백질가수분해 효소를 처리하여 독소단백질을 중쇄와 경쇄로 인위적 nicking을 시킴으로써, 기존 분리된 독소보다 특이역가가 5배 정도 상승된 B형 원료를 획득하였다. 셋째 방법으로 B형 중쇄단편에 특이적 단일클론항체인 BTBH-N1을 이용한 affinity column을 제조 완성하여, 상당히 특이적이고 회수율이 높으며, 분리시간의 단축과 분리과정 중 독소단백질의 유출도 최소화하는 분리법을 확립하였고 이 공정을 특허로 출원하였다.
준비된 B형 독소 원료는 반복 실험을 통해 결과의 재현성을 확인하였으며, 최종 준비된 원료는 전임상 연구 공인기관인, 한국화학연구원 부설 안전성 평가 연구소에 위탁연구를 의뢰하여, 필수 전임상 항목인 설치류 랫드를 이용한 단회 근육투여 독성시험과 4주간 근육내 반복투여 독성시험 및 비설치류인 비글독을 이용한 4주 반복 근육투여 독성시험을 실시하여 그 관찰결과를 획득하였다. 제2세부과제에선 보툴리눔 B형 독소의 in vivo test 확립하여 이를 통해 균일한 주사제 원료로의 B형 보툴리눔 독소의 품질관리가 가능하게 하였으며, 시제품 동결건조법을 확립하여 최소의 실활율을 보인 조건을 확립하였다. 또한 주사제 제조 시 필수적인 여러 안정화 제재를 이용한 시제품을 제조하여 역가와 실활율을 비교 분석하였다.
연구과제를 통해 얻어진 주사제 완제 시제품을 10회 이상 반복 생산하여 품질의 균일성을 검증하였으며, 기존 $LD_{50}$와 병행하여 주사제의 원료 및 완제품의 역가를 검증할 수 있는 새로운 in vivo test를 개발 중 이다. 또한 제품의 안정성 및 고특이역가 원료의 안정성을 시험하여, 시장 진입 시 상품화 가치를 장기간 확보할 수 있는 근거를 마련하였다.
연구과제 2년차부터 시작된 제3세부과제에선 교감신경절에서의 독소의 효과를 PC12 세포에서 비교하여 A형 및 B형 간의 작용을 비교하였다. 척수에서 보툴리눔 독소는 통증 유발물질인데 실험결과는 진통효과를 보여 새로운 연구의 중요 단서를 제공하였으며, 신경근 접합부에서의 A형과 B형 독소의 효과를 투여 후 시간경과에 따른 근전도 변화, 근육 크기의 변화 비교 관찰결과를 얻었다.
마지막 3차년도의 과제 수행을 통해, 제1세부와 제2세부 과제에서는 시제품 생산을 위한 원료생산의 균일화 및 분리 배치별 독소원료의 동일화를 검증하고, 이들 특성을 2D 및 HPLC 등 심화된 분석법을 확립하여 의약품으로의 안정성 및 적합성을 획득하였다. 고특이역가 독소를 이용한 B형 주사제의 개발을 위해 기존 독소를 이용해 진행되었던 일련의 과정을 반복 재현하여, 그 결과의 신뢰성과 이상 유무를 관찰하였고, 특이역가의 상승이 안정적으로 유지, 확인되는지 반복 시험하였다. 또한 새로운 in vitro & in vivo test법을 이용해 기존 원료 분석을 위해 활용되는 동물시험을 통한 역가 확인 시험법과 그 결과를 비교하여 기존 결과에 대한 분석법의 신뢰도와 정확도를 확보하였으며, 2차 년도부터 준비되어 진행해 온 설치류 랫트의 전임상 연구결과를 토대로, 차기단계에선 비글 독 이용한 비설치류 일반 독성시험을 진행하였고, 그 결과를 최종 종합하여 연구과제보고가 완료되는 시점까지 제출 할 예정이다. 제3세부 과제에서는 먼저 근육에 주입된 B형 보툴리눔 독소의 작용 양상을 A형 보툴리눔 독소와의 비교실험을 토끼를 대상으로 근전도를 이용하여 독소들의 확산 및 역가 등을 비교하였고, 다음으로 보툴리눔 독소가 투여된 근육의 병적 변화를 신경원성 및 근육원성 원인을 구별하기 위하여 조직학적 실험을 수행한 후 독소들의 독성반응을 비교하여 향후 임상적용 시 적절한 적응증을 탐색하기 위한 기초 자료를 제공하였고, 각 적응증에 맞는 합리적연 보툴리눔 선택 및 다양한 통증 관련된 적용 부위를 탐색하여 본 제품화개발 과제를 성공적으로 수행하기 위한 자료를 제공하였다.
결론적으로 과제수행을 통해 얻은 고특이역가의 B형 보툴라눔 독소를 주사제로 개발하기 위해 시제품의 반복 생산과 제조 공정을 확립 검증하였으며, 성공적언 전임상 시험을 통해 해당 제품이 신약으로 완성되기에 필수요건인 임상 진입의 기초를 마련하였다. 향후 임상 진행 시, 적용 가능한 분야 및 부위를 탐색한 연구 결과를 토대로 신약개발과정의 도입기를 성공적으로 마무려하였다.

Abstract ▼

In this project, "Development of Botulinum Toxin Type B Injectable type As a new drug" is on the biopharmaceuticals derived from the botulinum neurotoxin as therapeutics. First goal, Project part 1&2 (Medytox), was developed more potent toxin compare to native toxin using newly established methods (

In this project, "Development of Botulinum Toxin Type B Injectable type As a new drug" is on the biopharmaceuticals derived from the botulinum neurotoxin as therapeutics. First goal, Project part 1&2 (Medytox), was developed more potent toxin compare to native toxin using newly established methods (APTG, immuno-affinity chromatography, trypsin cleavage, reconstitution of recombinant toxin fragments). After production of high potent botulinum toxin type B, it was transferred to project part 2 as a source of injectable, and was tried to determine identical condition including several formulation process. More than 10 times continuous production for prototype product were accompanied with stability, consistency, unit operation and so on. From these results, prototype product was revealed that it had identical properties even after product manufactured. Also, investigation was performed using lot to lot prototype product to examine the deviation of properties and the possibility of abnormality. During that period, consignment preclinical study was also conducted to characterize toxicity using rodent (rat) & non-rodent (beagle dog). In project part 3 studied the difference effects between toxin type A and B in cervical ganglion and searched how to this new drug could be used for clinical application using pain model study. Finally, we successfully developed a highly potent botulinum neurotoxin type B and established a product process for making a prototype product. In future, we are planning to clinical study using new injectable type B drug which will be useful for therapeutic agent to treat various neurological disorders including pain.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 요약문 ... 6
• SUMMARY ... 8
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 18
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 36
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당함) ... 37
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 41
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 64
• 7. 참여연구원 편성표(총괄) ... 66
• 8. 첨부서류 ... 68
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 69
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 70
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 72
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 73
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 84
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 ... 85
• 6. 참고문헌 ... 99
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 101
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 102
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 104
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 105
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 108
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 ... 109
• 6. 참고문헌 ... 122
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 123
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 124
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 127
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 129
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 133
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 ... 135
• 6. 참고문헌 ... 142
• 첨부서류 ... 143