초록 ▼

생물공정 기술을 이용한 펩타이드제조 기반기술을 확보하기 위하여 에이즈 치료제로 최근에 발매된 T-20 (36mer)과 차세대 당뇨병 치료제로 개발되고 있는 GLP-1 (30mer)을 모델 펩타이드로 본 연구진의 재조합대장균을 이용한 융합시스템에의 적용 가능성을 확인하였다.
T-20 및 GLP-1은 각각 본 연구진의 융합시스템에 적용되어 total protein의 30% 이상 과발현되어 다른 보고에 비해 높은 발현율을 보였으나, T-20의 경우 수용성으로 발현된 융합단백질의 일부가 절단효소에 의해 분리되는 않는 결과를 보였으며,

생물공정 기술을 이용한 펩타이드제조 기반기술을 확보하기 위하여 에이즈 치료제로 최근에 발매된 T-20 (36mer)과 차세대 당뇨병 치료제로 개발되고 있는 GLP-1 (30mer)을 모델 펩타이드로 본 연구진의 재조합대장균을 이용한 융합시스템에의 적용 가능성을 확인하였다.
T-20 및 GLP-1은 각각 본 연구진의 융합시스템에 적용되어 total protein의 30% 이상 과발현되어 다른 보고에 비해 높은 발현율을 보였으나, T-20의 경우 수용성으로 발현된 융합단백질의 일부가 절단효소에 의해 분리되는 않는 결과를 보였으며, GLP-1의 경우 예상한 바와 달리 불용성으로 발현되었으나, 가용화시킨 후 간단한 재접힘 공정을 통해 수용성 융합단백질을 확보할 수 있었다. 그리고 on-column cleavage 기술이 적용 가능하여 기대한 결과가 도출되었다. 한편, 2가지 펩타이드 모두 절단효소에 의한 절단 효율이 기대보다 낮아 상업적 경제성을 확보하기 위해서는 저분자에서 효율이 높은 UBP 그룹(EC 3.4.2.15)을 이용한 절단수율 향상을 위한 연구가 추가로 요구됨을 확인하였다.
발현된 펩타이드의 C-terminal의 amidation 공정개발을 위하여, 본 연구진은 재조합효모를 이용해 african clawed frog에서 유래한 amidating enzyme인 PAM을 발현을 시키고자 다양한 유전자 구성을 시도하였다. 그러나 효소발현 시 insert된 유전자가 소실되는 등 문제가 발생하여 rat, human 유래의 다양한 유전자의 cloning을 통하여 추가적인 PAM 발현을 진행 중이다.
결론적으로 본 과제를 통하여 본 연구진이 보유한 단백질 발현 및 정제관련 기반기술은 30mer 이상의 펩타이드 제조에도 성공적으로 적용이 가능함을 확인하였지만 개구리에서 유래한 PAM은 다양한 시도에도 불구하고 재조합 효모에서의 발현을 유도하지 못해 향후 추가적인 개발이 필요한 것으로 판단된다. 10개월 간의 연구기간을 통해 본연구진 보유 기반기술을 활용한 의약용 peptide 제조공정의 proof-of-concept을 확보하였고 향후 다년과제를 통해 상업적으로 활용이 가능한 공정으로 완성할 계획이다.

Abstract ▼

For the purpose of setting up a flat-form technology for manufacturing peptides, a feasibility study was conducted to see whether the fusion system(E-coli) developed by APTech could be used to express two model peptides : T-20(36-mers) for ADIS treatment and GLP-1(30-mers) for diabetes.
The expre

For the purpose of setting up a flat-form technology for manufacturing peptides, a feasibility study was conducted to see whether the fusion system(E-coli) developed by APTech could be used to express two model peptides : T-20(36-mers) for ADIS treatment and GLP-1(30-mers) for diabetes.
The expression levels of both T-20 and GLP-1 were higher than 30% of total proteins. In the case of T-20, however, some of the solubly expressed fusion proteins were shown not to be cleaved by cleavage enzymes ; GLP-1 which had been unexpectedly expressed in an insoluble form came to be solublized through simple refolding process. On the other hand, on-column cleavage technology could be applied to this process technology. Further research on increasing cleavage efficiency using UBP group(EC 3.4.2.15), which is very efficient to low molecules, is deemed necessary to make this technology be used for commercial purpose.
In order to develop the process of amidating C-terminal of peptides expressed, various DNA constructs through recombinant yeast systems(Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae) were designed and tried to express PAM, an amidating enzyme originated from African clawed frog. The deletion problem of PAM gene which had been inserted into the construct occurred, therefore, the experiments for expressing PAM using various cloning of DNAs which were originated from rat and human are in progress.
In conclusion, we confirmed that our flat-form technology could be applied to manufacturing peptides of about 30 mers, but decided that further study to express PAM was needed. We secured the proof-of-concept for manufacturing pharmaceutical peptides on the basis of our flat-form technology for the research period of ten months, and plan to complete this technology which will be able to be adopted for commercial purpose in the future.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 목차 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 5
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 6
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 6
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 21
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 42
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당함) ... 43
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 51
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 66
• 7. 첨부서류 ... 67
• 최종보고서 비공개 승인요청서 ... 68
• 8. 참고문헌 ... 69