초록 ▼

[제1세부]
1) SOP의 알레르기 유발인자에 대한 억제효과
- SOP은 Th2 cytokine인 IL-5, IL-3, GM-CSF의 작용을 모두 억제하였다. 그리고 Th1 cytokine인 IL-6의 작용은 억제하였으나 TNF와 IL-6의 작용에는 영향을 미치지 않았다.
- SOP은 COX-2 활성을 억제하였으나 COX-1 활성에는 영향을 미치지 않았다. 그리고 SOP은 사람 백 혈구의 활성산소 생성 및 마크로파지의 NO 생성에는 영향을 미치지 않았다.
2) SOP을 선도로 합성한 신규 유도체들의 IL-5에

[제1세부]
1) SOP의 알레르기 유발인자에 대한 억제효과
- SOP은 Th2 cytokine인 IL-5, IL-3, GM-CSF의 작용을 모두 억제하였다. 그리고 Th1 cytokine인 IL-6의 작용은 억제하였으나 TNF와 IL-6의 작용에는 영향을 미치지 않았다.
- SOP은 COX-2 활성을 억제하였으나 COX-1 활성에는 영향을 미치지 않았다. 그리고 SOP은 사람 백 혈구의 활성산소 생성 및 마크로파지의 NO 생성에는 영향을 미치지 않았다.
2) SOP을 선도로 합성한 신규 유도체들의 IL-5에 대한 저해효과 연구
- 신규 화학구조의 합성물질은 3세부과제가 공급하였다. 본 세부과제는 SOP의 IL-5 저해 pharmacophore 결정에 있어 활성 분석을 담당하였으며, 또한 3세부과제와 공동으로 IL-5 작용을 저해하는 신규의 후보물질을 도출하였다.
3) 식물 추출물로부터 신규 IL-5 저해제를 탐색하는 기반연구
- 식물 추출물은 4세부과제가 공급하였다. 본 세부과제는 활성 분석을 담당하였으며 4세부과제와 공동으로 지실 (P. trifoliata)로부터 IL-5 작용을 저해하는 물질을 분리, 동정하였다.
4) SOP의 IL-5 작용에 대한 억제 작용기전 연구
- SOP은 IL-5 신호전이에 관여하는 JAK-2와 ERK1/2의 활성화를 억제하였으나 p38 kinase의 활성화에는 영향을 미치지 않았다. 또한 SOP은 IL-5 자극에 의한 c-myc 유전자의 발현에도 영향을 미치지 않았다.
5) 최적 후보물질의 Th2 cytokine에 대한 억제효과 및 IL-5 억제기전 연구
- 최적후보물질로 도출한 JSH-VII-3은 5-cyclohexylmethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)-chromen-4-one으로 명명하였다.
- JSH-VII-3은 IL-5 신호전이에 관여하는 JAK-1과 JAK-2의 활성화를 억제하였으며 또한 MAP kinase인 ERK1/2와 p38 kinase의 활성화도 억제하였다.
- 그리고 JSH-VII-3은 transcription factor인 STAT-1의 활성화를 억제하였으며 c-myc 유전자의 발현도 억제하였다.
[제2세부]
점막으로의 호산구 침윤은 호흡기 알레르기 질환에서 특징적 병리 현상이다. 이로한 호산구의 침윤이나 활성화에는 여러 가지 사이토카인이 관여하지만 이들 중 IL-5 가 가장 강력한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 천식은 여러 가지 병합요법d도 불구하고 유병률이 높아질 뿐 아니라 중증 천식 환자가 늘어나고 있다. 그러므로 새로운 천식 약제의 개발이 시급하다. 천식의 새로운 치료의 표적은 여러 가지가 있는데, 이들 중 주된 표적이 호산구와 IL-5이다. 최근 IL-5 단클론 항체가 개발되어 천식 환자에게 투여한 결과 동물 실험에서의 결과와는 달리 바람직하지 못하였다. 그러므로 천식의 관해를 위해 새로운 IL-5 억제제가 절실히 필요한 실정이다.
그러므로 본 연구에서는 한국에서 자생하는 회화나무(Sophorica japonica) 열매에서 추출한 sophoricoside인 SOP와 이를 선도물질로 하여 새로운 합성제를 제작하여 이들이 체외나 체외적으로 IL-5 억제능이 있는지를 규명하고 이를 통해 항 천식작용이 있는지도 규명하여 새로운 항 천식 약제로 개발하고자 하였다. 항 천식 작용은 난황으로 감작한 알레르기 마우스 모델에서 말초혈액 및 기도내의 호산구 침윤 정도, 난황 특이 IgE 항체의 변화 및 기관지 과민성을 관찰하였고, 체외에서는 천식 환자의 말초혈액에서 순수분리한 호산구를 IL-5로 활성화하여 이에 대한 억제능을 LTC4와 ECP를 측정하여 비교 검색하였다. 수십종의 활성물질중 독성이 없었던 SOP과 JSH VII-20-sodium salt는 기도 내 호산구 침윤을 억제하였으며 기도과민성도 억제하여 항 천식 작용을 나타내었다. 또한 SOP과 JSH VII-20-sodium salt 뿐 아니라 용해도는 낮았으나 JSH II-3, JSH VII-3, JSH VII-3, JSH 03-2등이 IL-5에 의한 호산구 활성화를 억제하였다 이러한 연구 결과는 SOP과 JSH VII-20-sodium salt가 항천식 제제임을 시사하는 것이므로, 향후 새로운 알레르기 약제로서 가능성이 있을 것으로 사료된다.
[제3세부]
1) SOP의 구조 중 효과에 필수적인 구조 (pharmacophore)를 규명하였다. isoflavonone 구조가 필요하며, 5위치 hydroxyl group에 cyclohexylmethyl 과 같은 bulky한 alkyl group의 도입이 효과를 증가시킬 뿐만 아니라 glucosyl group이 필요하지 않음을 확인하였다. Pharmacophore가 확정됨에 따라 이를 응용하여 신규 모핵구조가 도입된 유도체를 설계하고 합성하여 구조 활성관계를 연구하였다. JSH 2-3, 7-2, 8-3, 6-3, 03-Ⅰ-2, 03-Ⅰ-3, 03-Ⅰ-5, 03-Ⅰ-6, 03-Ⅰ-12, and 03-Ⅰ-21 의 화합물들은 Cell base assay에서 uM 수준의 IC50 값을 보여 줌으로서 효과가 우수한 화합물로 판정되었다. 이중 JSH 2-3과 7-3은 전임상 후보 물질로 연구되었다.
2) 신규 모핵으로 chalcone 계 유도체가 IL-5 억제 효과를 발현함을 확인 하였다. 이 중 JSH JSH 2-20, 6-20, 7-20, 8-20, and 03-Ⅱ-10은 Cell base assay에서 uM 수준의 IC50 값을 보여 줌으로서 효과가 우수한 화합물로 판정되었다. 이 중 JSH 7-20은 전임상 후보물질로 고려되고 있다.
3) 유효물질 JSH 2-3, 7-3, 7-20을 대량 제조하여 독성, 제제, 동물시험의 샘플로 사용되었다.
[제4세부]
본 과제의 선도물질인 sophoricoside를 대량 분리하여 각 세부과제에 제공하였으며, 기반 연구로 신이, 지실, 박태기나무로부터 IL-5 저해물질로 triterpene, flavonoid, lignan 등의 화합물 30종을 분리하였으며 그 중에서 3종은 신규화합물이었다.
[제5세부]
1) Sophoricoside에 대한 안전성 연구
Sophoricoside의 LD50 값은 2500 mg/kg 이상(po. sc. ip.)으로 추정할 수 있었으며, 복귀돌연변이시험법, 염색체이상시험 및 comet assay에서 결과가 음성이었으나, thymidine kinase forward gene mutation assay에서 대사활성 존재시 고농도에서 양성의 결과를 보였으며, in vivo에서 유전자 손상을 볼 수 있는 Supravital Staining 소핵시험에서도 양성으로 판정되었다..
2) Sophoricoside의 유도체들에 대한 안전성 연구
JSH-II-3의 경우는 comet assay와 thymidine kinase forward gene mutation assay에서 모두 양성의 결과를 보였으며, JSH-VIII-3은 comet assay에서 대사활성계 부재시에 양성의 결과를 나타내었다. 이외에 JSH-VII-3은 박테리아와 in vitro 시험계에서는 음성의 결과를 보였지만 mouse를 이용한 supravital 소핵시험에서 양성의 결과를 보였다. 반면 JSH-VI-3과 JSH-VII-20 및 최적 후보물질로 도출된 JSH-VII-20(Na-salt)은 현 시점에서 적용한 시험계에서는 유의한 양성의 결과를 보이지 않았다.
3) 지실로부터 분리한 21α, β-methylmelianodiol에 대한 안전성 연구 21α-methylmelianodiol는 대사활성계 존재시 comet assay에서 양성의 결과를 보였으나, 다른 시험계에서는 유의한 결과를 관찰할 수 없었다. 21β-methylmelianodiol의 경우는 모든 시험계에서 음성으로 판정되었다.
4) Sophoricoside에 대한 동력학적 연구
Sophoricoside를 생체시료에서 분석, 정량화하기 위하여 GC/MSD를 이용하여 genistein에 여러 유도체화 시약을 적용한 silylation 반응을 통한 분석 조건을 확립하여 생체 시료 중에서 sophoricoside의 생체시료의 최적분석조건 확립하였다.
Sophoricoside의 in vivo에서의 흡수에 관한 연구를 위하여 sophoricoside 100 mg/kg을 경구 투여하여 각 시간대별로 rat serum중의 sophoricoside의 농도 및 생체이용률 parameter를 구하였다. 정량한계농도 범위에서는 혈액채취시간은 24 시간까지 하는 것이 타당하며, Tmax는 7.6±0.4 hr이었고 반감기(t1/2)는 4.47±0.89 hr이며, Cmax는 3.56 ㎍/ml으로 계산되었다.
[제6세부]
회화나무에서 분리한 천연소재 SOP과 이로부터 도출된 후보물질의 SOP 유도체의 흡습성, 결정다형, 해리정수, 분배계수 등의 기초물성과 pH, 온도(40, 55, 70℃)에 따른 안정성 시험 결과 JSHⅡ-3, JSHⅦ-3, JSHⅦ-20 등의 최적 후보물질들을 확보하였고 이들의 분석법을 연구하여 HPLC에 의한 SOP의 분석법을 확립하였다. 또한 이들의 용해도 개선을 위해 가용화 시험을 실시하였으며, 최적 후보물질들의 in vivo에서의 흡수율을 알아보기 위하여 SDrat을 사용하여 흡수율을 test한 결과 JSHⅦ-20이 가장 양호한 혈중 농도를 나타내었다. 위의 결과를 토대로 SOP 및 그 유도체들의 제형연구를 실시하여 In vitro 및 in vivo 실험에서 계산된 예상 사람투여량으로 정제, 코팅제, 캅셀제 등의 제형으로 제조하여 physical parameter후 최적의 제형을 선택하여, 선택된 제형에 대한 안정성 시험, 용출시험을 통한 최적의 제형을 제조하였다.

Abstract ▼

[The first project]
1) Inhibitory effect of SOP on allergic chemical mediators
- SOP inhibited the bioactivity of Th2 cytokines such as IL-5, IL-3 and GM-CSF and that of Th1 cytokine of IL-6. However, the compound did not inhibit the bioactivity of TNF or IL-1.
- SOP was a selective inhibit

[The first project]
1) Inhibitory effect of SOP on allergic chemical mediators
- SOP inhibited the bioactivity of Th2 cytokines such as IL-5, IL-3 and GM-CSF and that of Th1 cytokine of IL-6. However, the compound did not inhibit the bioactivity of TNF or IL-1.
- SOP was a selective inhibitor of COX-2 activity, but did not affect the production of oxygen radicals or nitric oxide.
2) Inhibitory effects of synthetic SOP derivatives on IL-5 bioassay
- Pharmacophore of isoflavone SOP to inhibit IL-5 bioactivity has been elucidated with the synthetic derivatives.
3) Isolation of new IL-5 inhibitor from plant extracts
- Two compounds I and II have been isolated as the IL-5 inhibitors from P. trifoliata.
4) Inhibitory mechanism of SOP on IL-5-mediated signal transduction
- SOP inhibited JAK-2 and ERK1/2 but did not affect p38 kinase.
5) Inhibitory effect of new candidate JSH-VII-3 on Th2 cytokines and inhibitory mechanism of the compound on IL-5-mediated signal transduction
- New candidate, JSH-VII-3 is 5-cyclohexylmethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)-chromen- 4-one.
- The compound inhibited JAK-1 and-2, MAP kinases such as ERK1/2 and p38 kinase, as well as STAT-1 activation.
[The second project]
Infiltration of eosinophils in the respiratory mucosa is a consistent feature of allergic inflammation in asthma. Various cytokines, especially interleukin-5(IL-5), were identified to play important roles in the infiltration and activation of eosinophils. Even though Eosinophil and its activiating cytokine, IL-5, are new therapeutic targets of asthma, clinical trial of anti-IL-5 mAb did not showed the improvement in asthma. So new compounds targeting eosinophil or IL-5 is mandatory to remit asthma. In this study our group tried to synthesize new compounds, analogues of SOP extracted from Sophora japonica and also find out its antagonism on IL-5 in vitro and in vivo using murine asthma model.
The goal of this study was to investigate the antagonism of SOP and its synthetic analogues on IL-5-induced eosinophil activation and also eosinophilia and bronchial reactivity in ovalbumin(OA)-sensitized murine asthma model.
Male BALB/c or C57/BL6 mice sensitized intraperitoneally and then, topically with OA were treated with SOP or synthetic analogues, JSH II-3, JSH VII-3, JSH VII-20-sodium salt, intravenously 1 hour or per oral 4-6 hour before challenge and bronchial mucosa, peripheral blood eosinophilia, OA-specific IgE antibody production and bronchial reactivity were evaluated in vivo. In vitro antagonism, eosinophils purified from asthmatics stimulated IL-5 were treated with SOP and more than 30 synthetic analogues. LTC4 and ECP were measured.
SOP and JSH VII-20-sodium salt both showing no toxicity significantly inhibited the bronchial eosinophil infiltration and bronchial reactivity in vivo. In vitro eosinophil activation by IL-5 were inhibited significantly by sophoricoside, JSH II-3, JSH VI-3, JSH VII-3, JSH VIII-3 and JSH 03-2.
These findings suggest that sophoricoside and JSH VII-20-sodium salt have anti-eosinophilic cytokine activity and also plays an asthma blockade. Taken together, those two compouds may be a candidate for new anti-allergic medicine.
[The third project]
1) Pharmacophore of sophoricoside has been defined. Isoflavonone moiety is essential and glucosyl group is not essential, especially in the presence of cyclohexylmethoxy at position 5 as bulky hydrophobic group. Using this pharmacophore, novel isoflavones were designed, prepared and evaluated. As the results, compounds JSH 2-3, 7-2, 8-3, 6-3, 03-Ⅰ-2, 03-Ⅰ-3, 03-Ⅰ-5, 03-Ⅰ -6, 03-Ⅰ-12, and 03-Ⅰ-21 showed their inhibitory activity against IL-5 at uM level on cell based assay. Compounds JSH 2-3 and 7-3 were investigated as possible preclinical candidates.
2) Chalcones were identified as novel skeleton for the inhibition of IL-5 activity. Using this motif, novel chalcones were designed, prepared and evaluated. As the results, compounds JSH 2-20, 6-20, 7-20, 8-20, and 03-Ⅱ-10, showed their inhibitory activity against IL-5 at uM level on cell based assay..Compound JSH 7-20 is considered as a possible preclinical candidate.
3) The effective compounds JSH 2-3, 7-3, and 7-20 have been prepared as sample for toxicology, pharmaceutical prepations, and animal study.
[The 4th project]
Sophoricoside which is leading compound of IL-5 inhibitor was isolated and thirty natural compounds were isolated from the leaves of Cercis chinensis, fruits of Poncirus trifoliata and flowers of Magnolia kobus for the test of IL-5 inhibitory effect.
[The 5th project]
1) Toxicity study on Sophoricoside
LD50 of sophoricoside was presumed on ~2500 mg/kg in mouse(po. ip. sc.). Result of Ames assay, chromosomal aberration assay and comet assay was negative. However, thymidine kinase forward gene mutation was induced in high dose with S9 system, and result of in vivo supravital micronucleus assay was significant.
2) Toxicity assessment on derivatives of Sophoricoside
In the case of JSH-II-3, result of comet assay and thymidine kinase forward gene mutation assay was positive. And JSH-VIII-3 was induced single strand breaks without S9 system. In addition to those, while, JSH-VII-3 was negative in bacterial and in vitro system, it was induced significant micronucleus in mouse. On the other hand, JSH-VI-3, JSH-VII-20 and JSH-VII-20(Na-salt) was not observed genotoxicity in all assay system applied in this experiment.
3) Toxicity assessment of 21α, β-methylmelianodiol, a component of p. trifoliata While 21α-methylmelianodiol was induce single strand breaks with S9 system, result of other assay was negative. Also, 21β-methylmelianodiol was considered that it did not induced genotoxicity.
4) Kinetic study of Sophoricoside
Serum concentration of sophoricoside was measured by gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) in male Sprague-Dawley rat (250±10g, n=5) after oral administration of sophoricoside (100mg/kg). In the pharmacokinetic parameters, the Cmax(3.56±0.34 ㎍mL) value for sophoricoside in male rat was observed at 7.6 h. The elimination half-life(t1/2) of sophoricoside was approximately 4.47 h, the mean residence time (MRT) averaged 10.75 h, the total body clearance (Cl) averaged 0.0042 mL/min/kg. and the area under the serum concentration-time curve (AUC0-∞) was 24.93 ㎍ｫ․ｪ hr/mL.
[The 6th project]
Sophoricoside was isolated from Sophora Japonica. We investigated its hygroscopicity, bulk density,
pH solubility profiles, apparent partition coefficients, stability in various buffer solution and temperature(40, 55, 70℃), crystalline change. To investigate physico-chemical properties of SOP into consideration on formulation design, so to secure most suitable conductor. And We investigated Analysis method of SOP by HPLC. Moreover We investigated improvement of dissolution rate , absorption test by SD rat. We take above physico-chemical properties and other test of Sophoricoside into consideration on formulation design, so we will be able to formulate optimal drug delivery system.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 18
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 87
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획 ... 93
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 95
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 141
• 7. 참여연구원 편성표 ... 142
• 8. 첨부서류 ... 142
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 143
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 144
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 147
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 150
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 160
• 5. 참고문헌 ... 162
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 164
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 165
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 169
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 171
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 177
• 5. 참고문헌 ... 177
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 179
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 180
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 184
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 184
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 207
• 5. 참고문헌 ... 210
• 제4세부연구개발과제 연구결과 ... 212
• 1. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 213
• 2. 제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 215
• 3. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 215
• 4. 제4세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 229
• 5. 참고문헌 ... 230
• 제5세부연구개발과제 연구결과 ... 231
• 1. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 232
• 2. 제5세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 236
• 3. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 249
• 4. 제5세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 261
• 5. 참고문헌 ... 262
• 제6세부연구개발과제 연구결과 ... 271
• 1. 제6세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 272
• 2. 제6세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 275
• 3. 제6세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 279
• 4. 제6세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 285
• 5. 참고문헌 ... 286
• 첨부서류 ... 287