초록 ▼

위장관내에서 강한 접착성이 있고 강산과 분해 효소에 안정성을 소지하며 증가된 면역성을 나타내는 새로운 소재의 경구백신을 개발코자 하였다. 따라서, 경구백신을 위한 새로운 미세입자 제조 기술이 절실히 필요하다. 항산성과 점막접착성이 있는 polymer에 대한 자료를 수집하고, 여러 가지 화학적 수식을 통해 백신 전달체 제조에 용이하게 합성하고, FT-IR을 통해 합성을 확인하였다. 특히, 유용한 백신 전달체로 알려진 liposome의 안정성과 효용성을 높이기 위해 polymer에 소수성기인 palmitoyl group을 수식하였으며,

위장관내에서 강한 접착성이 있고 강산과 분해 효소에 안정성을 소지하며 증가된 면역성을 나타내는 새로운 소재의 경구백신을 개발코자 하였다. 따라서, 경구백신을 위한 새로운 미세입자 제조 기술이 절실히 필요하다. 항산성과 점막접착성이 있는 polymer에 대한 자료를 수집하고, 여러 가지 화학적 수식을 통해 백신 전달체 제조에 용이하게 합성하고, FT-IR을 통해 합성을 확인하였다. 특히, 유용한 백신 전달체로 알려진 liposome의 안정성과 효용성을 높이기 위해 polymer에 소수성기인 palmitoyl group을 수식하였으며, 수식된 curdlan(OPC), mannan(OPM), chitosan, scleroglucan(OPCS), pullulan(OPP) 유도체를 이용하여 liposome을 코팅하고 제조된 미세입자의 특성을 조사하였다. 실제로 쥐의 소장 점막을 사용하여 점막접착성을 측정함으로써 백신전달체로서의 가능성을 조사하였다. 그리고, 항원을 담지시켜 합성한 미세입자와 리포좀을 경구투여 시 위장관 내의 표적 전달 및 Peyer's patch로의 이동 및 경구면역 후 IgA를 중심으로 한 생체 내에서의 점액성 면역능을 분석하였다. 최종적으로 감염동물 모델에서 위장관내 병원성 미생물의 부착과 침투방어 여부를 분석하고 항원-특이 Ig를 다량 유도키 위한 새로운 메카니즘의 고효능, 생적합성, 방출 통제성, 경구용 점막접착성 면역백신을 개발하고자 하였다.
여러 가지 polymer를 사용하여 liposome을 코팅하기 위한 화학적 수식 기술을 확보하였으며 liposome membrane을 코팅하는 기술을 확립하였다. 면역원을 캡슐화 하여 경구 투여할 수 있는 제재로 제조 하였고, 인공위액에서 보다 안정한 백신 전달체를 제조하였다. Polymerized liposome의 입자의 크기, zeta-potential 값의 변화 등으로 코팅된 입자의 특성을 조사하였고 인공 위액과 혼합하여 안정성을 조사한 결과 polymerized liposome은 안정하였다. Rat의 소장 점막을 이용하여 접착성 시험을 수행한 결과, chitosan이 코팅된 liposome이 가장 우수한 점막접착성을 나타내었다.
GFP를 발현하는 Salmonella typhimurium(ST)을 고정한 후 리포솜으로 포장한 후 각 각 OPP, OPC, chitosan (STC), OPM 또는 OPCS 로 리포솜 표면을 코팅하였다. OPC로 포장된 ST-리포솜은 Peyer's patch와 장간막 림프절로의 운반이 다른 실험군(OPP, 리포좀 단독, 비코팅)에 비하여 유의하게 증가하였으며 혈청에서 IgG와 IgA도 유의하게 증가하였고 분비형 IgA도 또한 증가하였다. STC, OPM 그리고 OPCS의 경우 Peyer's patch와 장간막 림프절로의 운반은 STC에서 유의하게 증가하였다. ST에 대한 항체 OPCS 처리군이 다른 실험군에 비하여 유의하게 높았으며, ST-특이 IgA를 생산하는 세포도 가장 많았고 S. typhimurium을 감염시켰을 때 보다 높은 저항성을 나타냈다.
이러한 결과는 GFP (+)ve 세균이 백신 운반 체계를 평가하는데 매우 유용하며, OPC와 Scleroglucan과 같은 다당류를 리포솜에 결합하여 항원의 운반에 사용하면 보다 안정하고 효과적인 백신 운반체로 개발 될 수 있음을 시사한다.

Abstract ▼

Effective delivery of intact antigens to the mucosal associated lymphoid tissues are required for protective immune response. Oral antigen delivery is an attractive route for vaccination but there are some limitations such as acidic stress in the stomach and enzyme digestion in the intestine. To ove

Effective delivery of intact antigens to the mucosal associated lymphoid tissues are required for protective immune response. Oral antigen delivery is an attractive route for vaccination but there are some limitations such as acidic stress in the stomach and enzyme digestion in the intestine. To overcome such limitations, we prepared microparticle carrier for efficient antigen delivery. This report describes the effect of coating various polysaccharides to liposomes on antigen delivery to target organs such as Peyer's patch and mesenteric lymph node and their effect to induce mucosal immune response to protect against bacterial infection. Moreover, various encapsulation methods is proposed for the delivery of antigen such as protein and peptide drugs.
Polymer derivatives such as O-palmitoylcurdlan-sulfate (OPC), O-palmitoylpullulan (OPP), O-palmitoylmannan (OPM), and O-palmitoylcarboxymethylscleroglucan (OPCS) were chemically synthesized to coat the liposomal bilayer. The synthesized derivatives were confirmed by FT-IR analysis. Polymerized liposomes with the derivatives or soluble chitosan were prepared and characterized by TEM, ELS, and zeta-potential analyses. The stability in stimulated gastric fluid(SGF) was also evaluated. The size of polymerized liposomes increased as the polymer derivatives content of liposomes increased and the zeta-potential values changed according to the polymer derivatives. In SGF, polymerized liposomes was more stable than plain liposome. In muco-adhesive test using small intestine of a rat, chitosan showed the best muco-adhesive properties.
GFP-expressing Salmonella typhimurium (ST)-loaded microparticles were prepared with liposomes and then coated with OPC ,OPP, chitosan(STC), OPM or OPCS. Delivery of ST-loaded microparticles to Peyer's patches or mesenteric lymph nodes was significantly enhanced in OPC treated group. OPC also induced higher sIgA and serum IgG and IgA levels and protected mice from ST infection compared with liposome or OPP. STC was significantly effective in delivery compared to OPM or OPCS. However, OPCS produced both higher serum IgA levels and specific IgA secreting cells compared to liposome, STC and induced higher resistance against ST challenge.
These results indicate that GFP+ bacteria can serve as a useful tool for evaluation of vaccine delivery system and modified polysaccharide (such as OPC or OPCS) can be used as a potential adjuvant for effective oral immunization.

목차 Contents

• 요약문 ... 1
• SUMMARY ... 2
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 3
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 3
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 8
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 11
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 14
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 15
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 18
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 25
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 30
• 5. 참고문헌 ... 32
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 34
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 35
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 39
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 40
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 48
• 5. 참고문헌 ... 49