초록 ▼

두 종류의 대장균 발현 시스템(l세부, inclusion body 발현시스템, 2세부: soluble expression 시스템)을 동시에 개발하여 경제성을 비교 평가한 후, 최종적으로 경제성이 높은 inclusion body 발현시스템을 적용하였음. 특히, 발현 및 리폴딩 수율을 올리기 위해 신규 tPA변이제를 추가 개발하여 최종 M2tPA 균주를 특허출원 하였고 대량생산에 사용하였음.
- 고농도 배양조건 확립 및 분리정제 공정을 개발함.
- 재조합 t-PA의 기준 및 시험방법, 품질관리 시스템을 개발함.
- 동물

두 종류의 대장균 발현 시스템(l세부, inclusion body 발현시스템, 2세부: soluble expression 시스템)을 동시에 개발하여 경제성을 비교 평가한 후, 최종적으로 경제성이 높은 inclusion body 발현시스템을 적용하였음. 특히, 발현 및 리폴딩 수율을 올리기 위해 신규 tPA변이제를 추가 개발하여 최종 M2tPA 균주를 특허출원 하였고 대량생산에 사용하였음.
- 고농도 배양조건 확립 및 분리정제 공정을 개발함.
- 재조합 t-PA의 기준 및 시험방법, 품질관리 시스템을 개발함.
- 동물혈전 모델을 정립하고 생체 내 혈전 용해제의 활성을 평가함.
- 안정화를 위한 최적의 formulation 조건을 확립함.
- 전임상 시료의 확보와 전임상 시험(효능 및 독성시험)을 수행함.
이상의 연구개발과정을 통해 대장균을 이용한 재조합 t-PA의 실용화 공정 및 재조합 단백질의 고효율 생산 시스템을 확립함.

Abstract ▼

Tissue-type plasminogen activator is the most powerful thrombolytic enzyme due to the strict substrate specificity and the enhancement of its activity by binding to fibrin (1). The mammalian cell (CHO cell)-derived recombinant tPA has been clinically used for the treatment of acute myocardial infarc

Tissue-type plasminogen activator is the most powerful thrombolytic enzyme due to the strict substrate specificity and the enhancement of its activity by binding to fibrin (1). The mammalian cell (CHO cell)-derived recombinant tPA has been clinically used for the treatment of acute myocardial infarction and has recently been approved for use In deep vein thrombosis, pulmonary embolism and stroke (2). However, the mammalian cell-derived recombinant tPA has a strong disadvantage like short half-life in blood circulation (3). In addition, the cost and yield of production through mammalian cell system are less effective than production through E. coli expression system.
In this study, to Improve the translation efficiency and expression level of recombinant human tPA m E. coli expression system, we modified several nucleotide sequences in the N-terminal region of human tPA gene, which has rare codons in E. coli host. The expression level of tPA in E.coli host was remarkably increased by this modification. We have further developed various expression systems for tPA mutants, which have partial deletion analogs or fusion proteins of human tissue plasminogen activator. We constructed E.coli expression vectors for full-length form (pMtPA), its deletion mutant (pM2tPA) and various fusion forms. All of tPA derivatives were successfully expressed in E.coli system. Recombinant proteins of full-length form and deletion mutant were all produced in the cells as insoluble aggregates and then renatured to active forms through unfolding with urea (8M) followed by refolding process. Finally, we selected pM2tPA as a final production clone for recombinant tPA after comparison of production yield. Taken several results of efficacy study using a mouse carotid artery thrombosis model and preclinical toxicity test in mice together, we concluded pM2tPA was fully active and may be highly potential as a new thrombolytics.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 보고서 요약서 ... 4
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 8
• 2. 총괄연구결과 세부내용 ... 9
• 3. 향후 성과 추진 계획 ... 24
• 4. 참여연구원 편성표(총괄) ... 28
• 목차 ... 31
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 32
• 연구의 배경 ... 32
• 연구의 필요성 ... 33
• 연구의 목표 및 범위 ... 33
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 36
• 1. 국내ㆍ외 관련분야에 대한 기술개발 현황 ... 36
• 2. 연구결과가 국내ㆍ외 기술개발 현황에서 차지하는 위치 ... 36
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 37
• 1. 총괄연구 개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 37
• 2. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 49
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 50
• 1. 총괄연구개발과제의 목표 달성도 ... 50
• 2. 연구개발결과의 파급효과 ... 51
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 53
• 1. 연구개발결과의 활용계획 및 추가연구의 필요성 ... 53
• 2. 사업화(기업화) 목표 달성도 및 계획(해당과제만 작성함) ... 53
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 54
• 제 7 장 참고문헌 ... 55
• 제 8 장 첨부서류 ... 56
• 제1세부연구개발과제의 연구결과:재조합 tPA의 생산공정 확립 및 효능평가 시스템 구축 ... 57
• 1. 제1세부연구개발과제의 목표 ... 58
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 59
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 60
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 82
• 5. 제1세부연구개발과제의 목표달성도 ... 83
• 6. 참고문헌 ... 83
• 제2세부연구개발과제의 연구결과:t-PA의 soluble 발현 및 공정개발연구 ... 85
• 1. 제2세부연구개발과제의 목표 ... 86
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 89
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 91
• 4. 제2세부 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 107
• 5. 제2세부연구개발과제의 목표달성도 ... 108
• 6. 참고문헌 ... 109
• 최종보고서 비공개 승인요청서 ... 111
• 자체평가의견서 ... 113
• 대한민국특허청 ... 117
• 시험결과보고서 ... 142