초록 ▼

III. 연구개발의 내용 및 범위
대상 해충으로는 2011년도에 유전체 정보가 공개되어 다양한 유용 유전자를 쉽게 발굴할 수 있는 주요 화훼 및 원예작물 해충인 점박이응애로 선정하였다. RNAi를 기반으로 한 치사 유전자를 발굴하기 위해, 잎절편에 dsRNA 침지 후 점박이응애의 섭식을 유도하여 치사 효과를 판별할 수 있는 기법을 개발하였다. dsRNA 합성은 in vitro trancription 기법을 이용하였다. 준비된 4종의 dsRNA에 대한 독성평가는 특별하게 고안된 섭식용기를 이용하여 수행하였다. 이와 더불어 치사

III. 연구개발의 내용 및 범위
대상 해충으로는 2011년도에 유전체 정보가 공개되어 다양한 유용 유전자를 쉽게 발굴할 수 있는 주요 화훼 및 원예작물 해충인 점박이응애로 선정하였다. RNAi를 기반으로 한 치사 유전자를 발굴하기 위해, 잎절편에 dsRNA 침지 후 점박이응애의 섭식을 유도하여 치사 효과를 판별할 수 있는 기법을 개발하였다. dsRNA 합성은 in vitro trancription 기법을 이용하였다. 준비된 4종의 dsRNA에 대한 독성평가는 특별하게 고안된 섭식용기를 이용하여 수행하였다. 이와 더불어 치사 유전자를 좀 더 효율적으로 스크리닝하기 위해 인공즙액을 이용한 dsRNA 전달 기법 개발을 시도하였다. 1986년도에 개발된 주요 영양성분을 바탕으로 즙액을 만들고 점박이응애의 흡즙 여부 및 생존율을 조사하였다. RNAi 기작의 생리적인 현상을 이해하기 위해 dsRNA 및 살비제에 반응하는 기작을 전사체 분석을 통해 살펴보았다. 각 처리구에 대한 total RNA를 이용하여 각 처리구별 해당 유전자의 발현량을 TOPHAT, FPKM 등의 다양한 기법을 통해 분석하였다. 마지막으로 흡즙성 해충의 식물체 내에서 이행을 촉진시키기 위해 바이로이드 Loop7 염기서열을 dsRNA에 융합시켜 독성이 증대되는지 벼멸구를 대상으로 확인하여 보았다.

Abstract ▼

I. Transgenic crops expressing Bt toxin have been developed for the control of various lepidoteran and coleopteran pests. However, alternative genetical control methods is necessary for the emergence of bt-resistant pest populations. RNAi is known as the major gene regulation mechanism in the develo

I. Transgenic crops expressing Bt toxin have been developed for the control of various lepidoteran and coleopteran pests. However, alternative genetical control methods is necessary for the emergence of bt-resistant pest populations. RNAi is known as the major gene regulation mechanism in the developmental stages in eukaryotic organisms. Based on these phenomena, new pest control methods were suggested based on feeding dsRNA of physiological important genes to trigger the lethality of target pests. Monsanto Inc. reported that a transgenic corn expressing V-ATPase dsRNA could be useful for the control of lepidopteran pest. In addition, a transgenic cotton expressing CYP6 dsRNA increased insect toxicities to insecticides by decreasing the transcription level of detoxification enzymes. However, only a few research has been conducted on this RNAi-based pest control for sap-sucking pests. Here, we established a RNAi system based on dsRNA delivery via leaf disk feeding to screen for lethal genes in T. urticae. We also aimed to elucidate the dsRNA defense mechanism through transcriptome analysis and enhance the translocation of dsRNA in plant to increase the dsRNA toxicity.
II. dsRNA was synthesized by in vitro transcription of cDNA fragment using bi-directional promoters. Toxicity of four different dsRNAs was determined by feeding Tetranychus urticae with dsRNA using specifically designed feeding chambers. The artificial sap feeding system was tried as an alternative dsRNA delivery method in order to enhance the screening efficacy. Artificial sap was made of various ingredients and the mortality and feeding pattern were observed. Transcriptome analysis was conducted to identify the genes responding to dsRNA ingestion. The up- or down-regulated genes were analyzed by various programs, such as TOPHAT and FPKM analysis. Finally, viroid Loop7 sequence was fused to dsRNA to enhance the translocation of dsRNA within plant tissues.
III. To identify genes that kill T. urticae when knocked down via RNA interference (RNAi), several lethal genes were screened by the systemic delivery of dsRNA via leaf disc feeding. Four candidate genes (β subunit of coatomer protein, T-COPB2; M1 metalloprotease, T-M1MP; Ribosomal protein S4, T-RPS4; A subunit of V-ATPase, T-VATPase) and a reference gene (EGFP) were tested for RNAi. All dsRNAs that permeated the leaf disc (ca. 15-mm diameter) were detected at 12 h post-treatment, indicating that dsRNA moved through vascular tissues. To evaluate toxicity, mortalities were assessed for 120 h post-treatment with dsRNA. Treatment of T-COPB2, T-M1MP, T-RPS4 and T-VATPase dsRNAs resulted in 65.4%, 15.9%, 36.1% and 21.1% mortalities at 120 h post-treatment, respectively. Reduction of all target gene transcripts following dsRNA treatment was confirmed by quantitative PCR, demonstrating that dsRNA feeding-based RNAi could indeed kill T. urticae. Artifical feeding system was designed for the high throughput screening. The mortality of T. urticae was less than 30% within eight days of feeding. This result suggests the possibility of dsRNA delivery sap-sucking insects by artificial feeding system. Transcriptome analysis following dsRNA feeding revealed that about 800 genes were up- or down-regulated and their characterization is under progress. dsRNA fused with viroid loop 7 enhanced the toxicity of dsRNA, suggesting the incorporation of loop 7 sequence likely enhance the systemic translocation of dsRNA between plant tissues.
IV. The isolated gene will be utilized for the development of pest-resistant trangenic plants based on RNAi. It will be ultimately helpful in establishing an eco-friendly sustainable agriculture system by reducing pesticide usage without maintaining agricultural productivity. Leaf disc-mediated dsRNA screening methods will be useful in the high throughput screening of lethal genes for sucking pests. The transciption profiling following dsRNA feeding will be helpful in elucidating the mechanisms of RNAi toxicity and dsRNA uptake. Viroid sequence-fused dsRNA will be useful in improving the dsRNA translocation within plant tissues.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 6
• 목차 ... 8
• 제1장 서 론 ... 9
• 제1절 연구개발의 목적 ... 9
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 9
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 11
• 제1절 국내 연구 현황 ... 11
• 제2절 국외 연구 현황 ... 12
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 15
• 제1절 잎절편을 이용한 dsRNA 이행 기법을 통한 점박이응애 치사 유전자 발굴 ... 15
• 제2절 인공즙액을 이용한 dsRNA 전달을 통한 점박이응애 치사 유전자 발굴 ... 24
• 제3절 NGS를 활용한 dsRNA 섭식 반응 유용 유전자 발굴 ... 32
• 제4절 Transient expression을 이용한 형질 전환 식물체에서 효과 검증 ... 39
• 제5절 벼유묘를 이용한 벼멸구 dsRNA 처리 기법 개발 ... 41
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 48
• 제1절 목표대비 달성도 ... 48
• 제2절 정량적 성과 ... 48
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 50
• 제1절 연구개발결과의 활용방안 ... 50
• 제2절 기대성과 ... 50
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 51
• 제1절 해외 연구 현황 ... 51
• 제7장 기타 중요 변동사항 ... 54
• 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 55
• 제9장 참고문헌 ... 56
• <참고> 주요 연구성과 요약 ... 61