초록 ▼

1차년도
∙B형간염바이러스(hepatitis B virus, HBV)의 증식에 의해 미토콘드리아가 핵 주변으로 모이게 됨을 밝힘
⋅HBV가 증식하는 세포에서는 미토콘드리아가 핵 주변으로 모였으나, 대조군인 Huh7 세포와 HBV priming-deficient mutant (HBV RNA와 단백질이 발현되지만 증식하지는 못함)발현세포는 세포전체에 분포
⋅여러 세포신호전달 및 전사조절기능을 하며 미토콘드리아의 핵 주변 응집에 관여하는 HBV의 X단백질(HBx)의 역할을 제외하기위해 HBx를 발현하지 못하는 HBV X-

1차년도
∙B형간염바이러스(hepatitis B virus, HBV)의 증식에 의해 미토콘드리아가 핵 주변으로 모이게 됨을 밝힘
⋅HBV가 증식하는 세포에서는 미토콘드리아가 핵 주변으로 모였으나, 대조군인 Huh7 세포와 HBV priming-deficient mutant (HBV RNA와 단백질이 발현되지만 증식하지는 못함)발현세포는 세포전체에 분포
⋅여러 세포신호전달 및 전사조절기능을 하며 미토콘드리아의 핵 주변 응집에 관여하는 HBV의 X단백질(HBx)의 역할을 제외하기위해 HBx를 발현하지 못하는 HBV X-deficient mutant construct를 제작하여,
⋅확립한 HBV X-deficient pooled-stable 세포에서도 미토콘드리아가 핵 주변으로 응집하였음
⋅즉, HBx가 없어도 미토콘드리아가 핵 주변으로 모이는 신호는 증식하고 있는 HBV에 의한 것으로 생각됨
2차년도
∙HBV가 증식하면 ER과 peroxisome도 미토콘드리아처럼 핵 주변으로 응집됨
⋅HBV가 증식하면 microtubule을 따라 이동하는 세포소기관이 핵 주변으로 응집됨(HepG2-유래 및 Huh7-유래세포 모두에서); HepG2 및 Huh7세포와 HBV priming-deficient mutant발현세포는 세포소기관 응집 없음
∙HBV증식에 의한 미토콘드리아의 핵주변 응집을 정량화하기위해 미토콘드리아의 세포내 면적을 수치화함
⋅대조군인 Huh7 세포에서의 미토콘드리아의 세포내 면적은 ∼75%인 반면,
⋅HBV가 증식하지 못하는 HBV 발현 stable 세포에서의 미토콘드리아의 세포내 면적은 ∼87%임
⋅HBV가 증식하는 stable 세포에서의 미토콘드리아의 면적은 42∼47%이며,
⋅또한 HBV-X-deficient stable pooled 세포에서의 미토콘드리아의 면적은 약 ∼50%였음
∙즉, HBx가 없어도 HBV가 증식하면 microtubule을 따라 이동하는 세포소기관인 미토콘드리아, ER, peroxisome이 핵 주변으로 모이게 됨
∙HBx과발현세포와 달리 신호전달과정에 Ras-Raf-mitogen-activated protein kinase(MAPK)가 관여하지않음
3차년도
∙HBx가 없어도 HBV가 증식하면 핵에서 HBV의 covalently closed circular DNA(cccDNA)가 검출됨
⋅HBV cccDNA가 핵에 존재한다는 의미는 세포질에서 역전사과정으로 합성된 HBV replicative intermediate(RI) DNA가 있는 HBV의 core 입자가 핵으로 이동하였음을 말해주는 것임
⋅HBV가 증식하지 않는 세포의 핵에는 cccDNA가 없으므로 HBV immature core 입자(encapsidation된 pregenomicRNA만 있음)는 핵으로 이동하지 못한다는 것임
⋅HBV RI DNA가 핵으로 이동하려면 HBV의 mature core 입자(증식된 RI DNA있음)가 핵막으로 이동해야함
∙HBV DNA가 합성된 HBV의 mature core 입자는 핵막으로 이동하여 핵막공과 핵막 수용체와 결합함
⋅HBV가 증식하는 세포에서는 HBV의 core 입자가 수용성 핵수용체(importin-β)와 핵막공과 함께 위치하고 있음을 confocal microscopy로 관찰하였음
⋅또한 importin-β와 HBV의 core 입자가 결합하고 있음을 면역침강-Western blot(IP-WB)으로 밝혔음
∙HBV의 mature core 입자의 핵으로의 이동은 microtubule을 따라서 이동하며 dynein motor protein이 관여함
⋅HBV가 증식하는 세포에서는 HBV의 core 입자가 tubulin과 약하게 결합하고 있음을 confocal microscopy와 IP-WB으로 밝혔음
⋅세포소기관이동에 microtubule이 관여함을 microtubule을 depolymerize하는 nocodazole처리로 확인하였으며,
⋅HBV가 증식하는 stable 세포에서의 세포소기관이동에 dynein motor protein이 관여함을 nocodazole과 dynein ATPase 억제제인 erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine(EHNA)처리로 밝혔음
⋅HBV 증식 세포의 HBV core 입자가 dynein과 결합함을 IP-WB으로 밝혔음
⋅HBV가 증식하지 않는 세포에 있는 HBV immature core 입자에서는 위의 현상이 없음
∙HBV의 mature core 입자가 핵으로 이동하기 위해서는 microtubule dynamics 조절이 필요함
⋅HBV가 증식하는 세포에서 microtubule이 불안정하여도, 또는 안정되어도 HBV core 입자가 핵으로 이동하지 못함을 microtubule을 깨는 nocodazole, 또는 microtubule을 polymerize하는 taxol을 처리하여 밝혔음
⋅또한 대조군 Huh7세포(100%)와 HBV priming-deficient mutant발현세포(106%)보다 HBV가 증식하는 stable 세포에는 acetylated tubulin(60%)이 감소되어 있음
⋅HBV가 증식하는 세포에서 tubulin deacetylase인 histone deacetylase 6(HDAC6)가 관여하여 tubulin을 deacetylation시켜 microtubule dynamics를 조절하는 것으로 생각됨
※ 종합적인 결론: 증식하는 HBV는 microtubule dynamics를 조절하여 dynein-dependent traffic을 촉진하여 HBV RI DNA가 있는 core 입자가 핵으로 이동하도록 함으로써 핵에서 cccDNA가 만들어짐을 밝힌 연구

목차 Contents

• 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
• 목 차 ... 3
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 5
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 7
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 7
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 7
• Ⅲ. 연구성과 ... 8