초록 ▼

○ 연구결과
KNF2016 균주는 Pseudomonas oleovorans로 동정되었으며, 5L jar fermentor에서 배양최적화를 거쳐 500L 산업용 발효조에서 대량 배양하였다. 이후 후처리 공정을 통해 25% WP의 시제품을 제조하였다. 항바이러스 기작 분석을 통해 KNF2016의 활성물질은 내열성을 갖고 있으며 계면활성제에 안정한적인 단백질성 물질인 것으로 밝혀졌다. 또한 다양한 생물검정을 통해 KNF2016의 활성물질이 바이러스에 직접 작용하여 분절효과가 나타나는 것을 밝혔으며, 치료효과보다는 예방적 효과가 우수

○ 연구결과
KNF2016 균주는 Pseudomonas oleovorans로 동정되었으며, 5L jar fermentor에서 배양최적화를 거쳐 500L 산업용 발효조에서 대량 배양하였다. 이후 후처리 공정을 통해 25% WP의 시제품을 제조하였다. 항바이러스 기작 분석을 통해 KNF2016의 활성물질은 내열성을 갖고 있으며 계면활성제에 안정한적인 단백질성 물질인 것으로 밝혀졌다. 또한 다양한 생물검정을 통해 KNF2016의 활성물질이 바이러스에 직접 작용하여 분절효과가 나타나는 것을 밝혔으며, 치료효과보다는 예방적 효과가 우수한 것으로 밝혀졌다. 항바이러스 물질의 분리 정제는 다양한 분석기법을 동원하여 진행되었으나 아미노산 서열 분석이나 해당 유전자 분석 등의 후속 연구가 진행되어야 한다. 한편 KNF2016 25% WP의 포장시험은 5종류의 식물바이러스병해에 대해 실시하였는데 우수한 방제효과를 나타내었으며, 원제 및 시제품에 대한 독성시험은 저독성 및 어독성 Ⅲ으로 나타나 인축 및 환경에 매우 안전한 것으로 나타났다.

Abstract ▼

For the development of biopesticide for plant virus control, we isolated strain with antiviral activity. Strain was identified to be closely related to Pseudomonas oleovorans with a sequence identity of 99.19% by 16S rDNA sequence analysis. This strain was named as KNF2016. Culture characteristic an

For the development of biopesticide for plant virus control, we isolated strain with antiviral activity. Strain was identified to be closely related to Pseudomonas oleovorans with a sequence identity of 99.19% by 16S rDNA sequence analysis. This strain was named as KNF2016. Culture characteristic analysis, formulation, down stream process processing and field trial of experimental product were conducted for the industrialization of KNF2016. Antiviral activity of KNF2016 did not decrease even though ten times of continuous broth sub-culture. 1% glucose, 0.05% MgSO4·7H2O, 1% yeast extract, 0.1% KH2PO4, and 0.5% Na2HPO4 were selected as a medium source for industrialization. In case of controling of p.H. 7 by acetic acid feeding, O.D (optical density) was increased to 79 but activity of plant virus control was not increased. 500L fermentation could shorten a culture time of 7hours through the culture broth transfer. Down stream process of broth culture was examined with concentration, ultra filtration and freeze dry. After we consider about economical efficiency and antiviral activity, freeze dry after concentration were selected. Through the investigation of two times of recipe and activity improvement test using co-formulants, 25% WP(wettable powder) was selected. Efficacies of KNF2016 (25%WP, 1/500 dilution) against TMV in tobacco plant, PePMoV in pepper plant, CGMMV in water melon plant, ZYMV in cucumber and PVY in uninfected potato were 90.0%, 100%, 79.4%, 86.2%, and 73%, respectively in field trial. Technical and experimental product of KNF2016 were examined to acute oral toxicity, acute dermal toxicity and fish toxicity. As a results, each lethal dose 50 (LD₅₀) of acute oral toxicity and acute dermal toxicity were over 5,000mg/kg. In case of fish toxicity, lethal concentration (LC50,48hrs) was over 10ppm.
A filtrate powder, designated as KNF2016, produced from culture broth of P. oleovorans was tested for their inhibitory effects on Pepper mild mottle virus (PMMoV) infection to Nicotiana glutinosa or N. tabacum cv. Xanthi nc. When 1/100 dilution with distilled water was treated to the plants and PMMoV was inoculated, the inhibition was estimated to be 94.3 and 95.6% respectively. The same concentration of KNF2016 inhibited infection of Pepper mottle virus (PepMoV) and Cucumber mosaic virus (CMV) on Chenopodium amaranticolor by 97.1 and 92.5%, respectively. Duration of inhibitory activity of the filtrate powder from P. oleovorans culture broth against PMMoV infection on N. glutinosa was maintained for 2 days at 80% inhibition level, however, the inhibitory effect was diminished from 4 days after treatment to 50% levels. To evaluate inhibitory effects on systemic host plants of the antiviral agent, symptom developments of PMMoV, PepMoV and CMV on KNF2016-treated pepper plants were investigated. Delayed symptom developments until 10 days after inoculation (DAI) were observed for all the three viruses when the viruses were inoculated individually, and these delayed symptom development effects were maintained until 30 DAI in case of PepMoV. Moreover, PepMoV was not detected by RT-PCR and ELISA until 30 DAI. These delayed symptom development effects were diminished in all combinations of three virus co-inoculations due to synergism of three viruses on symptom developments. Inhibitory effect of KNF2016 was verified under electron microscopic examinations using purified virus preparations. Particles of PMMoV and PepMoV were observed on specimens from 5 min after KNF2016 treatment, and the particle sizes were reached in the range of 200 ~ 250 nm and 400 ~ 600 nm, respectively. Furthermore, the viral particles were destructed and particle sizes were reached in the range of 100 ~ 150 nm and 300 ～ 500 nm, respectively, on 60 min after treatments. Reduction of local lesion numbers on N. tabacum cv. Xanthi nc and C. amaranticolor were accompanied with reduction of virus particle sizes. In the case of CMV destructed particle numbers were also increased according to incubation period after KNF2016 treatment and local lesions on C. amaranticolor were reduced.

목차 Contents

• 제 출 문 ... 1
• 연구개발보고서 초록 ... 3
• 요 약 문 ... 4
• SUMMARY(영문 요약문) ... 24
• CONTENTS(영문목차) ... 28
• 목 차 ... 32
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 36
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 40
• 제 3 장 연구개발 수행내용 및 결과 ... 43
• 제 1 절 연구개발 수행 내용 ... 43
• 1. 항바이러스 활성 균주 연구 ... 43
• 가. 후보균주 선발 및 보관방법 ... 43
• 나. 선발균주의 형태, 생리적 특성 및 동정 ... 43
• 다. 항바이러스 활성의 특성연구 ... 43
• 2. 산업화를 위한 대량배양 연구 ... 44
• 가. Complex 배지에서 기초배양 및 활성검정용 시료배양 ... 44
• 1) 균주의 생물검정 농도 결정 ... 44
• 2) 계대 배양의 안정화 ... 44
• 3) 균주의 기본적인 발효조 배양 양상 ... 44
• 나. 배양 최적화를 위한 배지 선발 ... 45
• 1) 탄소원 ... 45
• 가) 탄소원 선발 ... 45
• 나) 탄소원 농도 선발 ... 45
• 2) 질소원 ... 46
• 가) 질소원 선발 ... 46
• 나) 질소원 농도 선발 ... 46
• 3) 미량요소 선발 ... 46
• 4) 5L jar fermentation ... 47
• 5) Acetic acid feeding과 p.H. 조절 ... 47
• 다. Pilot 수준에서의 scale up 개발 ... 47
• 1) scale up ... 47
• 3. 항바이러스 활성의 작용기작 분석 ... 48
• 가. KNF2016의 바이러스 억제효과 검정 ... 48
• 1) 접종방법 및 처리방법에 따른 억제효과 분석 ... 48
• 2) 단일 및 복합감염에 따른 바이러스 억제효과 검정 ... 48
• 3) KNF2016의 종자처리에 의한 억제효과 검정 ... 48
• 4) 바이러스 세포내 증식 및 이동 억제효과 분석 ... 48
• 5) KNF2016의 이화학적 특성과 바이러스억제효과 ... 49
• 나. KNF2016의 작용기작 규명 ... 49
• 1) 국부 및 전신 감염에 따른 작용기작의 해석 ... 49
• 2) 바이러스 입자, 단백질 및 RNA의 영향 분석 ... 50
• 가) 바이러스 입자 및 단백질에 미치는 영향 ... 50
• 나) 바이러스 게놈 RNA에 미치는 영향 ... 50
• 3) 바이러스 종류별, 기주별 작용기작의 비교 분석 ... 51
• 4) 감염세포내 항바이러스 기작의 분자적 해석 ... 51
• 다. KNF2016의 적용 스펙트럼 분석활용 ... 52
• 1) 즙액 및 종자전염성 바이러스의 억제효과 ... 52
• 2) 고추 및 박과작물의 바이러스 종류별 억제효과 ... 53
• 4. 활성물질 특성분석 및 순화 ... 53
• 가. 화학적 특성분석을 위한 순화된 시료 확보 ... 53
• 1) 항바이러스물질의 용해도에 따른 순화 ... 53
• 2) 항바이러스물질의 크기별 순화 ... 53
• 나. 부분 순화된 항바이러스물질의 다당체 가능성 검정 ... 54
• 1) 부분 순화된 항바이러스물질의 1H-NMR ... 54
• 2) 항바이러스물질의 다당체 가능성 검정 ... 54
• 다. 부분 순화된 항바이러스물질의 polypeptide구조를 가질 가능성에 대한 검정 ... 54
• 1) 항바이러스물질의 polypeptide 구조를 가질 가능성에 대한 검정 ... 54
• 2) SDS-PAGE를 이용한 단백질 확인 ... 55
• 3) FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)를 이용한 항바이러스물질로 추측되는 단백질의 순화 ... 55
• 4) 항바이러스활성 분획의 protease activity 분석 ... 55
• 5) 항바이러스물질과 protease 활성물질간의 연관성 검정 ... 56
• 6) Bench-top scale에서 생산된 항바이러스물질의 순화 ... 57
• 5. 항바이러스 물질의 제형화 ... 57
• 가. 후처리 공정 개발 ... 57
• 1) Filtration ... 57
• 2) 동결건조 ... 57
• 나. 제형화 연구 ... 58
• 1) 기본제형 처방검토 ... 58
• 2) 약효증진 처방검토 ... 58
• 3) 경시안정성 시험 ... 59
• 6. 항바이러스 활성 검정 ... 59
• 가. 모델시스템을 활용한 활성검정 ... 59
• 나. 포장시험 ... 60
• 1) 담배 TMV 효과시험 ... 60
• 2) 고추 PepMoV 효과시험 ... 60
• 3) 수박 CGMMV 효과시험 ... 60
• 4) 고추 CMV 효과시험 ... 60
• 5) 오이 ZYMV 효과시험 ... 60
• 6) 감자 PVY 효과시험 ... 61
• 7. 안전성 연구 ... 61
• 제 2 절. 연구개발 결과 ... 62
• 1. 항바이러스 활성 균주 연구 ... 62
• 가. 선발균주의 형태, 생리적 특성 및 동정 ... 62
• 1) 형태적 특성 ... 62
• 2) 생리적 특성 ... 62
• 3) 균주동정 ... 64
• 나. 항바이러스 활성의 특성연구 ... 69
• 1) KNF2016 균주와 동일한 종의 Type 균주와 항바이러스 활성비교 ... 69
• 2) 식물병원균 및 항생물질검정용 공시균주에 대한 생육억제 활성검정 ... 69
• 3) KNF2016 만들어내는 고분자 물질과의 활성 비교 ... 70
• 2. 산업화를 위한 대량배양 연구 ... 70
• 가. Complex 배지에서 기초배양 및 활성검정용 시료배양 ... 70
• 1) 균주의 생물검정 농도 결정 ... 70
• 2) 계대 배양의 안정화 ... 71
• 3) 균주의 기본적인 발효조 배양 양상 ... 72
• 나. Complex 배지에서 기초배양 및 활성검정용 시료배양 ... 73
• 1) 탄소원 ... 73
• 가) 탄소원 선발 ... 73
• 나) 탄소원 농도 선발 ... 74
• 2) 질소원 ... 75
• 가) 질소원 선발 ... 75
• 나) 질소원 농도선발 ... 76
• 3) 미량요소 선발 ... 77
• 4) 삼각플라스크에서의 최적조건 ... 77
• 5) 5L jar fermentation ... 78
• 6) Acetic acid feeding & p.H. 조절 ... 79
• 다. Pilot 수준에서의 scale up 개발 ... 80
• 1) Scale up ... 80
• 3. 항바이러스 활성의 작용기작 분석 ... 82
• 가. KNF2016의 바이러스 억제효과 검정 ... 82
• 1) 접종방법 및 처리방법에 따른 억제효과 분석 ... 82
• 2) 단일 및 복합감염에 따른 바이러스 억제효과 검정 ... 83
• 가) 병징의 변화에 따른 억제효과의 판별 ... 83
• 나) PCR 및 ELISA검정에 의한 효과의 검정 ... 83
• 3) KNF2016의 종자처리에 의한 억제효과 검정 ... 86
• 4) 바이러스 세포내 증식 및 이동 억제효과 분석 ... 88
• 5) KNF2016의 이화학적 특성과 바이러스억제효과 ... 92
• 나. KNF2016의 작용기작 규명 ... 95
• 1) 국부 및 전신 감염에 따른 작용기작의 해석 ... 95
• 가) 국부감염에 따른 감염기작 ... 95
• 나) 전신감염에 따른 감염기작 ... 96
• 다) KNF2016의 처리에 따른 바이러스 병징 발현 양상 및 식물체내 바이러스 분포현황 ... 97
• 라) PCR 검정의 결과 ... 99
• 2) 바이러스 입자, 단백질 및 RNA의 영향 분석 ... 101
• 가) 바이러스 입자 및 단백질에 미치는 영향 ... 101
• 3) 바이러스 종류별, 기주별 작용기작의 비교 분석 ... 104
• 가) 병징 변화에 따른 검정 ... 104
• 나) ELISA검정 ... 105
• 4) 감염 세포내 항바이러스 기작의 분자적 해석 ... 106
• 다. 항바이러스 생물농약의 적용 스펙트럼 분석활용 ... 108
• 1) 즙액 및 종자전염성 바이러스의 억제효과 ... 108
• 2) 고추 및 박과작물의 바이러스 종류별 억제효과 ... 109
• 4. 항바이러스 활성 물질의 특성 및 순화 ... 110
• 가. 화학적 특성분석을 위한 순화된 시료 확보 ... 110
• 1) 항바이러스물질의 용해도에 따른 순화 ... 110
• 2) 항바이러스물질의 크기별 순화 ... 110
• 나. 부분 순화된 항바이러스물질의 다당체 가능성 검정 ... 110
• 1) 부분 순화된 항바이러스물질의 1H-NMR ... 110
• 2) 항바이러스물질의 다당체 가능성 검정 ... 112
• 다. 부분 순화된 항바이러스물질의 polypeptide 구조에 대한 가능성 검정 ... 114
• 1) 항바이러스물질의 polypeptide 구조를 가질 가능성에 대한 검정 ... 114
• 2) SDS-PAGE를 이용한 단백질 확인 ... 115
• 3) FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)를 이용한 항바이러스물질로 추측되는 단백질의 순화 ... 115
• 4) 항바이러스활성 분획의 protease activity 분석 ... 116
• 5) 항바이러스물질과 protease 활성물질간의 연관성 검정 ... 117
• 6) Bench-top scale에서 생산된 항바이러스물질의 순화 ... 119
• 5. 항바이러스 물질의 제형화 ... 122
• 가. 후처리 공정 개발 ... 122
• 1) Filtration ... 122
• 2) 동결건조 ... 123
• 나. 제형화 연구 ... 125
• 1) 기본제형 처방검토 ... 125
• 2) 약효증진 처방검토 ... 128
• 3) 경시안정성 시험 ... 131
• 6. 항바이러스 활성 검정 ... 131
• 가. 모델시스템을 활용한 활성검정 ... 131
• 나. 포장시험 ... 132
• 1) 담배 TMV 약제 방제 효과시험 ... 132
• 2) 고추 PepMoV 약제 방제 효과시험 ... 133
• 3) 수박 CGMMV 약제 방제 효과시험 ... 134
• 4) 오이 ZYMV 약제 방제 효과시험 ... 135
• 5) 감자 PVY 약제 방제 효과시험 ... 135
• 7. 안전성 연구 ... 137
• 가. KNF2016 원제의 마우스를 이용한 단회 투여 경구독성시험 ... 137
• 나. KNF2016 원제의 랫드를 이용한 단회 투여 경피독성시험 ... 140
• 다. KNF2016 원제의 잉어를 이용한 단회 투여 급성독성시험 ... 144
• 라. KNF2016 25% WP의 마우스를 이용한 단회 투여 경구독성시험 ... 147
• 마. KNF2016 25% WP의 랫드를 이용한 단회 투여 경피독성시험 ... 151
• 바. KNF2016 25% WP의 잉어를 이용한 단회 투여 급성독성시험 ... 154
• 제4장 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 158
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 164
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 165
• 제7장 참고문헌 ... 166