초록 ▼

< 연구목표>
1) 본 연구는 이식 후 동일한 공격세포에 의해 서로 상반된 면역효과 (GVHD와 GVL)를 차별화 할 수 있는 기술을 개발하고 이에 대한 평가체계를 구축하는 것이다.
2) 이를 위해 1차년도 연구에서 제시된 GVHD 마우스모델, GVHD 역가 시험법 및 세포추적기술 등의 기반 기술을 이용하여 공격세포의 이동 관련 인자를 규명하고 이를 조절하는 기술을 개발하여 GVHD 표적장기로의 이동을 억제하고 상대적으로 종양세포로의 이동을 확대하여 GVHD발생억제 및 GVL 유도를 위한 세포치료제 평가기반을 구축하고자

< 연구목표>
1) 본 연구는 이식 후 동일한 공격세포에 의해 서로 상반된 면역효과 (GVHD와 GVL)를 차별화 할 수 있는 기술을 개발하고 이에 대한 평가체계를 구축하는 것이다.
2) 이를 위해 1차년도 연구에서 제시된 GVHD 마우스모델, GVHD 역가 시험법 및 세포추적기술 등의 기반 기술을 이용하여 공격세포의 이동 관련 인자를 규명하고 이를 조절하는 기술을 개발하여 GVHD 표적장기로의 이동을 억제하고 상대적으로 종양세포로의 이동을 확대하여 GVHD발생억제 및 GVL 유도를 위한 세포치료제 평가기반을 구축하고자 한다.
< 연구내용 및 성과>
1) GVHD+tumor 모델 제작 및 SOP 개발:
-BU-CY로 전처치 후 A20 세포 주입으로 백혈병 마우스를 만들고, 이어 동종의 골수세포 및 비장시 포를 이식하여 만듦.
-생존율 : 백혈병마우스는 30 일 이내에 모두 사망한제 비해 여기에 비장세포가 투입된 경우는 생존율이 향상되었는데 GVHD와 더불어 GVL이 유도되었기 때문임.
2) 표적장기의 GVHD관련 Cytokine과 chemokine 분석:
-GVHD유발 3일째 표적장기를 적출해서 Luminex multiplex assay 방법으로 31가지의 cytokine 과 chemokine을 동시에 측정했음.
-대조군에 비해 GVHD 군에서 G-CSF, keratinocyte-derived chemokine (KC; CXCL1), MIP-2(CXCL2), 및 IL-23 가 표적장기 모두에서 증가했음
3) 본 연구에서는 표적장기의 GVHD 유발 대표후보물질은 CXCL2로 정하였고 이에 대한 T-세포 수용체는 KC와 CXCL2 의 공통 수용체인 CXCR2로 정하였음.
4) CXCR2/MIP-2 (CXCL2)의 차단에 의한 GVHD 평가 및 SOP 개발
-생존율은 anti-CXCR2 antibody 처리 후에 GVHD 의 발생이 지연되고 생존율이 향상되었고 CXCR2 및 CXCL2에 대한 항체를 동시에 처리한 경우는 더욱 향상되었음.
-공여 GFP 발현 비장세포의 표적장기 이동도 CXCR2/CXCL2 차단에 의핸 예방되었는데 두가지 후보물질 모두를 차단하는 경우가 더욱 우수하였음.
-표적장기의 염증성 사이토카인 분비가 (G-CSF, IL-13, IL-1a, IL-6, IL-9, IFN-c, KC, MCP-1, CXCL2, IL-23, 및 TIMP-1) CXCR2/CXCL2 축의 차단에 의해 감소되는데 두 후보물질 모두 차단한 경우가 효과가 우수하였음.
5) CXCR2/MIP-2 (CXCL2)의 차단에 의한 GVL 평가 및 SOP 개발:
-이식후 3주째 평가하였는데 골수와 말초혈에서 단핵세포를 분리해서 암세포의 양의 정도를 측정하였고 A20의 oncogene인 BCL-2 표지장의 표현정도를 Real-time PCR로 측정, GVL을 평가하였음.
-CXCR2/CXCL2 축의 차단에 의해 암세포의 양이 감소되었는데 두 후보물질 모두를 차단하는 경우가 효과가 우수하였음.
-즉, CXCL2/CXCR2 축의 차단에 의해 GVHD 약화의 효과가 있지만 동시에 GVL의 약화를 초래하지는 않아 두 면역반응의 차별화에 성공하였음.
6) 중간엽줄기세포의 GVHD, GVL에 대한 효과 : 중간엽줄기세포를 이식하였을때 조직학적 점수, 암세포량 측정에 의하면 GVHD의 호전은 유발하지만 GVL과의 차별화를 유도하지는 못함.

Abstract ▼

< Purpose>
Strategies that effectively separate the beneficial effects of GVL from the adverse effects of GVHD are necessary to reduce the mortality and morbidity of BMT we compared the abilities of several cytokines and chemokines released from the small intestine, liver, and skin to selectively

< Purpose>
Strategies that effectively separate the beneficial effects of GVL from the adverse effects of GVHD are necessary to reduce the mortality and morbidity of BMT we compared the abilities of several cytokines and chemokines released from the small intestine, liver, and skin to selectively recruit T cells to these organs during the acute phase of GVHD.
< Results>
1) Clinical manifestations of GVHD
-A tumor-bearing mouse model of GVHD was established . Leukemia was induced in mice conditioned with BU-CY by injection with A20 cells. Subsequently, allogenic BMCs for leukemia or BMCs plus SP cells for GVHD were transplanted.
-Major target organs of GVHD, including intestine and liver, showed clear histopathological evidence of GVHD.
-At day 21 post-SP transplantation, mucosal crypts in the GI tract (small intestine, and colon) were severely disturbed, showing hyperplasia and hyperchromatic nuclei with numerous cells exhibiting apoptotic characteristics.
2) Cytokine and chemokine expression in GVHD target organs
-On day 3 of GVHD induction, we harvested GVHD target organs (liver and colon) and measuring cytokine and chemokine protein levels using the Luminex multiplex assay.
-The most frequently upregulated proteins were G-CSF, keratinocyte-derived chemokine (KC; CXCL1), MIP-2(CXCL2), and IL-23.
3) KC and CXCL2 are homologue proteins that act on the same receptor (CXCR2), which implies that targeting CXCR2 might have a duel effect, addressing two proteins that are both upregulated during GVHD in our model.
4) Blockade of the CXCR2/MIP-2 (CXCL2) axis attenuates the GVHD response
-We found that the combined blockade of CXCR2 and CXCL2 caused an additional reduction of GVHD, evidenced by enhanced survival and attenuated histopathologic determinants of GHVD.
-The presence of GFP-expressing donor cells in target organs was prevented by CXCR2/CXCL2 blockade.
5) Blockade of the CXCR2/CXCL2 axis decreases inflammation in target organs
-Inhibition of CXCL2/CXCR2 axis attenuated overall inflammation, and specifically the levels of G-CSF, IL-13, IL-1a, IL-6, IL-9, IFN-c, KC, MCP-1, CXCL2, IL-23, and TIMP-1, which were upregulated in liver and intestine during the initial stage of GVHD.
6) Blockade of the CXCR2/CXCL2 axis retains the GVL effect
-Twenty-one days after transplantation, MNCs were isolated from BM and PB to compare the prevalence of red fluorescent cells. The proportion of red fluorescence-expressing cells was significantly decreased by inhibition of the CXCR2/CXCL2 axis, as well as the expression of oncogene BCL-2.
7) Effect of mesenchymal stem cell (MSC) to GVHD and GVL
-MSC attenuated GVHD, it did not hinder the ability of donor T cells, but fail to separate to the GVL response.

목차 Contents

• 용역연구개발과제 최종보고서 ... 1
• 표지 ... 2
• 제출문 ... 4
• 목 차 ... 5
• Ⅰ. 총괄연구개발과제 요약문 ... 7
• 1. 국문요약문 ... 7
• 2. Summary ... 9
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 11
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 11
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 25
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 34
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 52
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 53
• 제6장 총괄참고문헌 ... 54
• 제7장 총괄첨부서류 ... 55