보고서 정보
주관연구기관 |
식품의약품안전평가원 National Institute of Food and Drug Safety Evaluation |
연구책임자 |
안치영
|
참여연구자 |
엄준호
,
박기대
,
김민정
,
강소영
,
오호경
,
백정희
,
김호
,
우정남
,
김용국
,
성다빈
,
서나리
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2019-12 |
과제시작연도 |
2019 |
주관부처 |
식품의약품안전처 Ministry of Food and Drug Safety |
등록번호 |
TRKO202000029902 |
과제고유번호 |
1475011026 |
사업명 |
의약품등안전관리(R&D) |
DB 구축일자 |
2020-09-26
|
키워드 |
유도만능 줄기세포.직접교차분화.분화.품질.고려사항.Induced pluripotent stem cells(iPSCs).Direct reprogramming.Differentiation.Quality.Points to Consider.
|
초록
▼
< 1세부 > 유도만능줄기세포 유래 심근세포의 품질평가 지표 발굴 및 품질평가시험법 제시
유도만능줄기세포를 이용하여 심근세포 분화법을 확립하여, 분화된 심근세포의 생리학적 활성 및 분화단계별 지표의 발현경향을 확인하였다. 매트리젤과 feeder free 배양법을 활용하여, 유도만능줄기세포를 43일(약6주)동안 심근세포로의 분화를 유도하였다. 심근분화 2주차부터 전체적으로 sheet를 형성하여 심박동이 관찰된다.
분화된 심근세포의 생리학적 활성을 확인하기 위하여, 심근세포의 분화단계별 검체를 이용하여 활동전위, 필드
< 1세부 > 유도만능줄기세포 유래 심근세포의 품질평가 지표 발굴 및 품질평가시험법 제시
유도만능줄기세포를 이용하여 심근세포 분화법을 확립하여, 분화된 심근세포의 생리학적 활성 및 분화단계별 지표의 발현경향을 확인하였다. 매트리젤과 feeder free 배양법을 활용하여, 유도만능줄기세포를 43일(약6주)동안 심근세포로의 분화를 유도하였다. 심근분화 2주차부터 전체적으로 sheet를 형성하여 심박동이 관찰된다.
분화된 심근세포의 생리학적 활성을 확인하기 위하여, 심근세포의 분화단계별 검체를 이용하여 활동전위, 필드포텐셜, 칼슘신호의 크기를 분석하였다. 분화가 2, 4, 6주로 진행될수록 기간 및 탈분극 속도가 유의적으로 증가하였고, 최대이완기 막전압도 보다 안정적으로 재분극됨을 확인하였다. 필드포텐셜 분석에서는 분화가 진행될수록, 박동의 빈도, 크기, 기간이 유의적으로 증가하였다. 칼슘이미징 분석을 통해 분화가 진행될수록 세포내 칼슘변화량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
분화단계별 지표발굴을 위하여, 미분화세포(유도만능줄기세포), 심근전구세포(또는 중배엽세포), 심근세포 단계에서 발현되는 지표를 조사하였고, 유전자, 단백질, 세포수준에서 발현경향을 분석하였다. RT-PCR 분석결과 미분화세포의 지표인 Oct-4, Sox2는 유도만능줄기세포에서는 강하게 발현하다가 심근세포분화 1주차부터 급격히 발현이 감소하였고, 심근전구세포 지포의 ISL-1은 분화1주차에 가장 높이 발현되다가, 분화가 진행될수록 감소하는 경향을 보였다. 심근세포지표인 cTnT, MLC2, MHC는 분화가 진행될수록 발현이 증가하였다. Western blot 분석결과 Oct-4는 분화시작일에 가장 높이 발현되고, 분화가 진행될수록 발현양이 감소하였다. 심근전구세포 지표인 IST1, TBX5는 분화1주차에 가장 많이 발현되다가 분화가 진행될수록 점차 감소하는 경향을 보인다. cTnT는 분화 2주차부터 발현되어, 분화 6주차에 가장 강하게 발현되었다. 유세포분석(FACS)결과 미분화세포지표인 Oct-4, Sox2 발현세포 비율은 분화시작일에는 80% 이상이었다가 분화 1주차부터는 0.4% 이하로 급격이 감소하였다. ISL1은 분화1주차에 가장 많이 발현되었다. cTnT와 MHC의 경우, cTnT를 고도로 발현하는 세포 (cTnT high) 및 MHC를 고도로 발현하는 세포의 비율이 분화가 진행될수록 증가하였다. 이러한 시험결과를 바탕으로 순도시험 지표로 Oct-4, Sox2, 확인시험 지표로 cTnT, MHC, 공정중관리지표로 ISL-1을 제안한다.
유도만능줄기세포에서 심근세포로 분화하는 동안 유전적 변이여부를 확인하기 위해 유전적 안정성 분석시험을 수행하였다. 염색체 마이크로어레이와 줄기세포유전자 패널과 종양유전자 패널을 이용한 NGS 분석 결과 분화과정 동안의 유전적 변이는 관찰되지 않았다.
유도만능줄기세포 유래 분화심근세포의 품질평가 시험법으로 RT-PCR, Western blot, FACS, MEA assay를 검증하고, 확립하였다. 특이성, 정밀성등을 검증하고, 각 지표별 SOP를 마련하였다. RT-PCR, Western blot, FACS는 확인, 순도시험에 적합하며, MEA assay는 역가시험에 적합할 것으로 사료된다.
< 2세부 > 체세포의 직접교차분화 유도 및 특성평가, 직접교차분화 세포치료제의 품질평가 기반 마련
직접교차분화는 분화된 세포를 이용하여, 중간 단계인 전분화능 상태를 거치지 않고 다른 특정한 세포로 분화시키는 것이다. 전분화능 상태를 거치지 않기 때문에 종양원성 위험을 줄일 수 있어 관련 기술을 이용하여 세포치료제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 직접교차분화기술을 도입하여 사람 섬유아세포를 이용하여 신경줄기세포를 유도하였다. Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 유전자를 센다이 바이러스 벡터를 이용하여 도입하였으며 배지조성 등 환경요인을 조절하여 신경줄기세포를 유도하였다.
유도된 신경줄기세포의 특성을 확인하기 위하여 세포의 형태학적 관찰, PI staining을 통한 DNA content 분석, qPCR을 통한 관련 유전자 발현 분석, ICC를 통한 관련 단백질 발현을 분석하였다. 신경줄기세포의 분화능을 확인하기 위해, 신경세포(neuron)로 분화를 유도하였으며, 유전적안정성을 확인하기 위한 핵형분석을 실시하였다. 이를 바탕으로 직접교차분화기술 기반 세포치료제의 특성분석 및 품질관리에 활용할 수 있는 평가기술을 제시하였으며, 허가심사시 활용할 수 있는 품질평가 기초자료 활용하고자 한다.
(출처 : 요약문 2p)
Abstract
▼
1. Study on Quality Control Markers and Quality Control Test of Cardiomyocytes Derived from Human Inducible Pluripotent Stem Cells
Cardiomyocyte differentiation method was established using induced pluripotent stem cells, and the physiological activity of differentiated cardiomyocytes and express
1. Study on Quality Control Markers and Quality Control Test of Cardiomyocytes Derived from Human Inducible Pluripotent Stem Cells
Cardiomyocyte differentiation method was established using induced pluripotent stem cells, and the physiological activity of differentiated cardiomyocytes and expression trends of differentiation stages were identified. By using Matrigel and feeder free culture, induced pluripotent stem cells were induced to differentiate into cardiomyocytes for 43 days (about 6 weeks). From the second week of myocardial differentiation, a heartbeat was observed by forming a sheet.
In order to confirm the physiological activity of differentiated cardiomyocytes, action potential, field potential, and magnitude of calcium signal were analyzed using samples of differentiation stages of cardiomyocytes. As the differentiation progressed to 2, 4 and 6 weeks, the period and depolarization rate were significantly increased, and the maximum diastolic membrane voltage was also stably repolarized. In the field potential analysis, as the differentiation progressed, the frequency, size and duration of the beat increased significantly. Calcium imaging analysis confirmed that the intracellular calcium changes increased as the differentiation progressed.
In order to detect the differentiation stages, the markers expressed in undifferentiated cells (induced pluripotent stem cells), myocardial progenitor cells (or mesodermal cells), and cardiomyocytes were examined and expression trends were analyzed at the gene, protein, and cellular levels. The results of RT-PCR analysis showed that Oct-4 and Sox2, which are indicative of undifferentiated cells, were strongly expressed in induced pluripotent stem cells, but decreased rapidly from the 1st week of myocardial cell differentiation. However, as the differentiation progressed, it tended to decrease. Cardiomyocyte markers cTnT, MLC2, MHC expression increased as the differentiation progressed. Western blot analysis revealed that Oct-4 was the highest at the beginning of differentiation and decreased in expression as differentiation progressed. Myocardial progenitor cell markers, IST1 and TBX5, were most expressed at differentiation week 1 and gradually decreased as they progressed. cTnT was expressed from the second week of differentiation, and was most strongly expressed at the sixth week of differentiation. As a result of flow cytometry (FACS), the percentage of Oct-4 and Sox2 expressing cells, which were undifferentiated cell markers, decreased more than 80% at the start of differentiation, but decreased to less than 0.4% from the 1st week of differentiation. ISL1 was most expressed at week 1 of differentiation. In the case of cTnT and MHC, the proportion of cells that express high cTnT (cTnT high) and cells that express high MHC increased with differentiation. Based on these test results, we propose Oct-4, Sox2 as purity test indicators, cTnT, MHC as identity test indicators, and ISL-1 as in-process control indicators.
Genetic stability assays were performed to determine the genetic variation during differentiation from induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes. Chromosomal microarrays and NGS analysis usingstem cell gene panels and oncogene panels revealed no genetic variation during the differentiation process.
RT-PCR, Western blot, FACS, and MEA assay were verified and established for the quality assessment of induced pluripotent stem cell-derived differentiated cardiomyocytes. Specificity and precision were verified, and SOPs for each index were prepared. RT-PCR, Western blot and FACS are suitable for identification and purity test, and MEA assay is suitable for potency test.
2. Study on Characterization and Quality Control Assesment of Neural Stem Cell Derived through Direct Reprogramming
Direct reprogramming(direct conversion) is the use of differentiated cells to differentiate into other specific cells bypassing unstable intermediate pluripotent state. Research is actively underway to develop cell therapeutics using direct reprogramming technologies because it reduces the risk of tumorigenecity. In this study, a direct reprogramming technology was introduced to induce neural stem cells using human fibroblast. Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc was introduced using an senda viral vector and induced neural stem cells by adjusting environmental factors such as media. To identify the characteristics of induced neural stem cells, morphological observations of cells, DNA content analysis through PI staining, karyotyping, gene expression analysis through qPCR, and protein marker expression through ICC(immunocytochemistry). Finally, to asses the differentiaion ability to neuron, we tried to differentiate neural stem cell to neuron. We observed morphological change and neuron marker(Tuj1 and MAP2) expression. Based on this study, we provided basic data on the quality assessment(control) of the ability to differentiate and the biological characteristics of the cellular treatment based on the technology for direct reprogramming.
(출처 : Summary 4p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 국문 요약문 ... 2
- Summary ... 4
- 목차 ... 7
- 연구개발과제 연구결과 ... 8
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 8
- 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 14
- 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 17
- 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 130
- 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 141
- 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 143
- 제7장 참고문헌 ... 146
- 제8장 첨부서류 ... 149
- 끝페이지 ... 285
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.