보고서 정보
주관연구기관 |
(주)제니아 |
연구책임자 |
박완제
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2013-02 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
보건복지부 |
과제관리전문기관 |
질병관리본부 Korea Center for Diease Control and Prevention |
등록번호 |
TRKO201300030810 |
과제고유번호 |
1355062017 |
사업명 |
감염병관리기술개발연구(구.질병관리연구지원) |
DB 구축일자 |
2013-12-21
|
키워드 |
H1N1 Influenza virus.Mouse.Pathogenicity.Plaque assay.PCR.DNA Sequencing.Virus Characterization.
|
초록
▼
1. 2009년 H1N1형 influenza virus에 대한 마우스 병원성주 생산
질병관리본부에서 제공한 wild type의 H1N1 pandemic 2009-A/korea/2785/2009 인플루엔자 바이러스를 사용하여 마우스에서 병원성을 보이는 인플루엔자 바이러스를 만들기 위해서 ㈜오리엔트바이오에서 구입한 inbred mouse 5종(Balb/c, C57BL/6, C3H, DBA/1J, DBA/2N)을 대상으로 실험을 수행하였다.
5종의 inbred mouse에 2일 간격으로 반복적인 lung-to-lung pass
1. 2009년 H1N1형 influenza virus에 대한 마우스 병원성주 생산
질병관리본부에서 제공한 wild type의 H1N1 pandemic 2009-A/korea/2785/2009 인플루엔자 바이러스를 사용하여 마우스에서 병원성을 보이는 인플루엔자 바이러스를 만들기 위해서 ㈜오리엔트바이오에서 구입한 inbred mouse 5종(Balb/c, C57BL/6, C3H, DBA/1J, DBA/2N)을 대상으로 실험을 수행하였다.
5종의 inbred mouse에 2일 간격으로 반복적인 lung-to-lung passage 결과, Balb/c, DBA/1J, DBA/2N 3종에서 폐사율 증가 및 폐사기간 단축에서 의미가 있는 mouse pathogenicity를 1차로 확인하였다. Balb/c에서 얻어진 15, 26 passage와 DBA/1J에서 얻은 13, 19 passage의 lung homogenate를 이용하여 plaque assay 및 plaque purification을 통해 각 passage당 5 clone 씩 총 20clone을 분리하였고 이를 MDCK 세포주에 감염시켜 마우스 병원성 바이러스를 확보하였다. Balb/c에 감염시킨 경우 10개 virus clone 중에서 6개 (15-1, 15-4, 15-6, 26-1, 26-4 및 26-5)의 virus clone이 1차 분석결과 높은 mouse pathogenicity를 보이는 것으로 확인되었으며 이중에서 4개(15-1, 15-4, 26-1 및 26-4)의 virus clone을 선택하여 재 검증을 실시하였다. 또한, DBA/1J mouse에 감염시킨 경우 10개 virus clone 중에서 7개 (13-1, 13-3, 13-4, 19-1, 19-3, 19-4 및 19-5)의 virus clone이 1차 분석결과 높은 mouse pathogenicity를 보이는 것으로 확인되었으며 이중에서 5개(13-1, 13-3, 19-1, 19-3 및 19-5)의 virus clone을 선택하여 역시 재 검증을 실시하였다.
결론적으로, Balb/c에서 15-1, 26-1의 virus clone들과 DBA/1J에서 13-1, 13-3, 19-3 및 19-5의 virus clone들을 최종 선정하였으며 상기 바이러스 주들은 “질병관리본부 인플루엔자 바이러스과”에 제공하였다. 유전자 서열분석 및 병원성 분석시험을 위해서 Balb/c_15-1 과 DBA/1J_13-3 virus clone을 선택하여 사용하였다.
2. 유전자 서열 정보 분석
Balb/c_15-1 및 DBA/1J_13-3 virus clone을 가지고 RNA 추출, cDNA 합성 및 각 유전자에 specific primer를 이용한 PCR product를 생성하였고 8개 유전자에 대해 모두 염기서열 분석을 완료하였다.
국내 최초 H1N1pdm09 분리주 (KR01)와 Balb/c_15-1 유래 H1N1 virus를 가지고 비교한 경우 8개 viral protein에서 총 15개의 아미노산 치환이 일어남을 확인하였고, 이중에 PA (2개), HA (4개), NP (2개) 그리고 NA (4개)의 viral protein에서 대부분의 변이가 관찰되었다. 또한, DBA/1J_13-3 유래 H1N1 virus의 경우에는 8개 viral protein에서 총 16개의 아미노산 치환가 일어남을 확인하였으며, 이중에 PA (3개), HA (4개) 그리고 NA (5개)의 viral protein에서 대부분의 변이가 관찰되었다.
특히, 인플루엔자 바이러스의 virulence와 host range에 주된 영향을 미치는 hemagglutinin (HA)에서 많은 아미노산의 치환이 일어났음이 확인되었으며, 아미노산 치환 위치는 서로 다른 부분에서 발생하였으나 변이빈도는 기존의 선행연구에서 보고된 연구결과와 매우 유사함을 확인하였다. 동시에 인플루엔자 바이러스의 다른 7개 viral protein에서의 아미노산 치환 정도도 매우 유사한 것으로 확인되었다. 본 연구에서 특징적인 것은 Balb/c_15-1 과 DBA/1J_13-3 유래 H1N1 virus 모두 HA glycoprotein에서의 아미노산 치환은 동일한 위치에서 동일한 아미노산으로의 치환된 것으로 미루어 아마도 이러한 변이가 두 실험동물의 virulence에 보다 많은 부분에서 기여한 것으로 생각된다.
3. Mouse-adapted H1N1 influenza virus의 병원성 분석
Balb/c-adapted H1N1 influenza viruses는 MLD50을 측정한 결과 75배 수준의 높은 virulence를 가지나, DBA/1J-adapted H1N1 influenza viruses의 경우는 wild type과 유사한 값을 보여 주었다.
Balb/c 및 DBA/1J mice에서 혈액학 측정 결과는 특징적으로 두 그룹 모두 급성염증에 대한 지표인 neutrophil의 상대수치가 유의적으로 크게 증가하였다. 혈액생화학 측정 결과 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 급속한 체중 감소에 기인하여 triglyceride의 함량이 통계적으로 유의성 있게 감소하는 현상이 관찰되었다. 그러나, 바이러스 감염 후의 관찰기간 동안에 바이오 마커로서 인정할 만한의미가 있는 생화학적 변화는 두 경우 모두 관찰할 수 없었다. H&E상의 조직학적 검경결과, 감염 2일차부터 병변이 뚜렷하게 관찰되었으며 병변은 G1과 G2에서 유사하게 관찰되었으며, 이외의 장기에서는 주목할 만한 병변은 확인되지 않았다. Plaque assay 결과에서도 7개 장기 중에서 단지 폐에서 높은 titer로 influenza virus가 감염되어 있음을 확인하였다.
Mouse-adapted H1N1 influenza mutant virus는 mouse에서 pathogenicity 및 lethality를 보이는 동시에 vaccination study에서는 wild- 및 mutant- H1N1에 무관하게 동일한 감염 방어효과를 보여주는 것으로 미루어 “Mouse를 이용한 H1N1 백신 및 치료제 효능평가 모델의 구축이 성공적으로 확립”되었다고 판단할 수 있다.
4. Mice-adapted H3N2 인플루엔자 바이러스의 생산
Wild type H3N2 인플루엔자 바이러스를 DBA/1J에 반복하여 passage 시킨 결과, 7 및 9 passage 에서 의미가 있는 폐사율 및 폐사기간 단축이 관찰되었으며, DBA/1J에서 유래한 H3N2 virus clone 6주 (DBA/1J 7 passage에서 3개 clone 및 9 passage에서 3개 clone)를 “질병관리본부 인플루엔자 바이러스과”에 제공하였다.
Abstract
▼
1. Development of 2009 H1N1 influenza virus mutant with mouse pathogenicity
5 inbred mice strains purchased at Orient Bio inc. (C57BL/6, Balb/c, DBA/1J, DBA/2N, C3H) were tested upon to develop mouse pathogenic influenza virus using H1N1 pandemic 2009-A/korea/2785/2009 wild type influenza virus p
1. Development of 2009 H1N1 influenza virus mutant with mouse pathogenicity
5 inbred mice strains purchased at Orient Bio inc. (C57BL/6, Balb/c, DBA/1J, DBA/2N, C3H) were tested upon to develop mouse pathogenic influenza virus using H1N1 pandemic 2009-A/korea/2785/2009 wild type influenza virus provided by Korea Center for Disease Control & Prevention.
Proceeding lung-to-lung passage to the 5 inbred strains repeatedly for every 2 days, we were able to identify from 3 strains, Balb/c, DBA/1J, DBA/2N with mouse pathogenicity which relates to increase of mortality rate and decrease of mortality period.
Passage 15, 26 and passage 13, 19 were derived from Balb/c and DBA/1J respectively. A total of 20 clones (5 clones per passage) were isolated from each lung homogenate through plaque purification. It was then used to infect MDCK cell strain to gain mouse pathogenic virus.
Amongst the 10 virus clones infected in Balb/c, 6 virus clones (15-1, 15-4, 15-6, 26-1, 26-4, 26-5) showed high mouse pathogenicity as a result of the 1st analysis and from them, 4 virus clones (15-1, 15-4, 26-1, 26-4) were chosen for a re-analysis in Balb/c mice. Also, amongst the 10 virus clones infected in DBA/1J, 7 virus clones (13-1, 13-3, 13-4, 19-1, 19-3, 19-4, 19-5) showed high mouse pathogenicity as a result of the 1st analysis and from them, 5 virus clones (13-1, 13-3, 19-1, 19-3, 19-5) were chosen for a re-analysis in DBA/1J mice.
15-1, 26-1 virus clones that showed pathogenicity in Balb/c mouse and 13-1, 13-3, 19-3, 19-5 virus clones that showed pathogenicity in DBA/1J mouse were finally chosen and were sent to the Influenza Virus Department at Korea Center for Desease Control & Prevention. For gene sequencing and pathogenic analysis Balb/c_15-1 and DBA/1J_13-3 virus clones were chosen and used
2. Gene sequence analysis from Balb/c_15-1 and DBA/1J_13-3 virus clone
With Balb/c_15-1 and DBA/1J_13-3 virus clone, we have performed the RNA extraction, cDNA synthesis, and also created PCR product with specific primer of 8 genes. It’s been completed for gene sequence analysis with 8 genes. The result of comparison with H1N1pdm09 isolate (KR01) and origin of Balb/c_15-1 H1N1 virus has shown 15 amino acids substitution occurred from 8 viral protein. From among these substitution, most of variation has observed from PA(2), HA(4), NP(2) and NA(4) of viral protein. Also in case of origin of DBA/1J_13_3 H1N1 virus has shown 16 amino acids substitution occurred from 8 viral protein. From among these substitution, most of variation has observed from PA(3), HA(4), NA(5) of viral protein. Particularly amino acids substitution has occurred from hemagglutinin (HA) which have effect on influenza virus’s virulence and host range. The location of amino acids substitution was irregular but numbers of substitution was similar with other previous results. Other 7 viral protein’s amino acids substitution is also similar with this study result.
Particularly through this study, we could find out that amino acids substitution from both origins of Balb/c_15-1 and DBA/1J_13-3 H1N1 virus were substituted with same amino acids, so that its transition may has an impact on animal’s virulence.
3. Pathogenicity Analysis of Mouse-adapted H1N1 influenza virus
As a result of measurement for MLD50, Balb/c-adapted H1N1 influenza virus has been showed 75-fold higher virulence when comparing to wild type. But, in case of DBA/1J-adapted H1N1 influenza viruses, it shows similar value in both types. Also we have investigated a hematological change in the mouse infected with Balb/c_15-1 and DBA/1J_13-3 virus. As a result, it shows significant increase of neutrophil as a marker of acute inflammation. And through the serum chemistry analysis, it clearly shows that dramatical decrease in the total quantity of triglycerides between the two groups in the mouse infected with Balb/c_15-1 and DBA/1J_13-3 virus is due to mainly weight loss after virus infection. But, in this study we could not find a remarkable changes which has recognized as biomarkers during the test period after infection with mouse adapted-influenza virus. Through the histopathology examination study, it has been clearly observed the lesion in lung and tracheal tissues from two days later after viral infection. In both G1 and G2 group, the level of lesion in lung and tracheal tissues was very similar, on the other hand, other tissues to be investigated did not show a remarkable lesion. We confirmed that only lung tissue among 7 organs has been highly infected with influenza virus through the plaque assay.
In conclusion, mouse-adapted H1N1 influenza mutant virus shows pathogenicity and lethality in mouse. At the same time, when we have challenged mouse-adapted H1N1 influenza mutant virus after vaccination with wild- and mutant-H1N1, it has been successfully protected from mutant virus. Therefore, we have established a good disease mouse model for the evaluation of vaccine and therapeutic agents.
4. Development of mice-adapted H3N2 influenza virus
Repeated passage of wild type H3N2 Influenza virus to DBA/1J resulted in noticeable decrease of mortality period in the 7 and 9 passages. 6 H3N2 virus (3 from 7 passage and 3 from 9 passage) that came from DBA/1J were sent to the Influenza Virus Department at Korea Center for Disease Control & Prevention.
목차 Contents
- 표 지 ... 1
- 질병관리본부 학술연구용역사업 최종결과보고서 ... 3
- 목 차 ... 4
- Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 5
- (한글) 마우스 병원성 2009년 H1N1형 인플루엔자 바이러스주 개발 ... 5
- (영문) Development of 2009 H1N1 influenza virus mutant with mouse pathogenicity ... 7
- Ⅱ. 학술연구용역사업 연구결과 ... 9
- 제1장 최종 연구개발 목표 ... 9
- 제2장 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 15
- 제3장 최종 연구개발 결과 ... 36
- 제4장 연구결과 고찰 및 결론 ... 103
- 제5장 연구성과 및 활용계획 ... 110
- 제6장 기타 중요변경사항 ... 114
- 제7장 연구비 사용 내역 및 연구원 분담표 ... 115
- 제8장 첨부서류 ... 117
- 제9장 참고문헌 ... 120
- 제10장 별첨 자료 ... 122
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.