초록 ▼

1) 1^st Year : Development of H3N2 (A/Victoria/361/2011) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity
Inbred DBA/1J 마우스에 매 2~3일 간격으로 반복적인 lung-cell-lung 및 lung-to-lung passage 방법을 통해 DBA/1J 마우스에서 폐사율의 증가 및 폐사기간 단축에 의미를 갖는 pathogenicity를 확인하였다. 반복적인 확인시험을 통해 pathogenicity를 확인한 후, plaq

1) 1^st Year : Development of H3N2 (A/Victoria/361/2011) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity
Inbred DBA/1J 마우스에 매 2~3일 간격으로 반복적인 lung-cell-lung 및 lung-to-lung passage 방법을 통해 DBA/1J 마우스에서 폐사율의 증가 및 폐사기간 단축에 의미를 갖는 pathogenicity를 확인하였다. 반복적인 확인시험을 통해 pathogenicity를 확인한 후, plaque purification을 통해 P14와 P19의 각 lung homogenate로부터 총 4개의 virus clone을 분리하였으며, 이를 다시 MDCK cell에 감염시켜 얻은 mouse pathogenic virus를 “질병관리본부 인플루엔자 바이러스과”에 제공하였다.

DBA/1J mouse pathogenic virus clones을 이용하여 RNA 추출, cDNA 합성을 진행하였으며, 8 gene의 specific primer를 이용하여 PCR product를 만든 후 8개의 유전자에 대한 염기서열 분석을 완료하였다. wild type과 4개의 mutant type의 Influenza virus를 비교하였을 때, 8개의 viral protein에서 11~16개의 아미노산 치환이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 아미노산이 치환된 위치는 불규칙하였으나 치환된 개수는 다른 선행연구와 유사함을 알 수 있었으며, 특히 주요한 아미노산 치환은 Influenza virus의 virulence와 host range에 영향을 줄 수 있는 Hemagglutinin(HA)에 발생하였다.

MLD₅₀을 측정한 결과, DBA/1J-adapted H3N2 Influenza mutant virus는 wild type과 비교하였을 때, 37~850배 높은 virulence를 나타내었고, MID₅₀의 경우는 70~33,000배 낮은 virus 농도에서도 높은 감염성을 보여주는 것을 확인할 수 있었다. 또한 DBA/1J-adapted H3N2 Influenza mutant virus를 마우스에 감염시켰을 때의 hematological 변화를 관찰하였다. 그 결과, 급성염증 지표인 neutrophil의 유의적인 증가를 확인할 수 있었으며, 혈청 생화학분석을 통해 DBA/1J-adapted H3N2 Influenza mutant virus 감염 후 급격한 체중 감소로 인하여 감염된 마우스의 triglycerides의 총 함량이 급속한 감소를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 바이러스 감염 후 관찰 기간 동안 biomarker로 인정할 만큼 눈에 띄는 변화는 확인할 수 없었다. Histopathology 시험을 통해, 감염 후 2일차 폐와 기관 조직에서 병변이 뚜렷하게 관찰되는 것을 확인하였다.

결론적으로 mouse-adapted H3N2 Influenza mutant virus는 마우스에서 lethality와 pathogenicity를 보이는 동시에 mutant 및 wild type을 vaccination하고 mouse-adapted H3N2 Influenza mutant virus를 감염시켰을 때, mutant virus에 대하여 완벽하게 방어하는 것으로 미루어 볼 때, Influenza virus의 치료제와 백신 평가에 대한 좋은 질병모델이 개발되었음을 확인하였다.

2) 2^nd Year : Development of H3N2 (A/Switzerland/9715293/2013) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity
Inbred Balb/c와 DBA/1J에 매 2~3일 간격으로 반복적인 lung-cell-lung 및 lung-to-lung passage 방법을 통해 Balb/c 및 DBA/1J 마우스에서 폐사율의 증가 및 폐사기간 단축에 의미를 갖는 pathogenicity를 확인하였다. Passage 6, 8, 9와 passage 5, 9, 11, 12, 13을 각각 Balb/c와 DBA/1J에서 선택하였으며 전체 26개의 clone이 plaque 정제를 통한 각각의 lung homogenate로 부터 분리하였다. 그런 후 마우스 병원성 바이러스를 대량 얻기 위하여 MDCK 세포 주에 감염시켰다. Balb/c에 감염된 12개의 바이러스 clone 중에서, 2개의 바이러스 clone(P8_C2, P9_C2)가 반복적인 확인시험 결과 가장 우수한 마우스 병원성을 보여주었고 최종적으로 Balb/c 내에서 추가적인 분석을 위해 선택되었다. 또한, DBA/1J에 감염된 14개의 바이러스 clone 중에서, 3개의 바이러스 clone(P9_C1, P11_C2, P13_C1)이 가장 높은 마우스 병원성을 보여주었고 최종적으로 DBA/1J 내에서 병원성 분석을 위해 최종 선택하였다.

유전자 서열분석과 병원성 분석을 위해, Balb/c와 DBA/1J 마우스에서 유래한 5개의 mutant virus clone을 선택하여 사용하였다. Balb/c(2 mutants)와 DBA/1J(3 mutants) 마우스 병원성 바이러스 clone으로부터 RNA 분리, cDNA 합성을 진행하고 또한 8개의 gene에 특이적인 primer를 이용하여 PCR 산물을 만들어 냈다. 8개의 gene 단편에 대한 유전자 서열분석을 완료하였다. 5개의 mutant type과 wild type을 비교한 결과, PB1, M 그리고 NS gene을 제외한 5개의 유전자에 해당하는 바이러스 단백질 내에서 7~14개의 아미노산 치환이 일어난 것을 발견하였다.

아미노산의 치환이 일어난 위치는 불규칙했지만 변화한 아미노산의 숫자는 이전의 다른 연구결과들과 유사했다. Balb/c와 DBA/1J에서 유래한 mutant virus clone을 다른 wild type virus와 아미노산 구성을 비교했을 때, 대부분의 치환은 바이러스 단백질의 HA(4~6), NA(1~2), NP(1~2),PA(3~5), PB2(1~2)에서 발견되었다. 대부분의 주요 아미노산 변화는 특히 인플루엔자 바이러스의 병원성과 숙주 범위에 영향을 주는 Hamagglutinin (HA)와 Nucleoprotein (NP) 부위에서 발생하였다.

MLD₅₀의 측정결과, Balb/c에서 유래한 mutant virus는 wild type과 비교하여 185~240배 이상의 높은 병원성을 보여주었다. 그러나, DBA/1J에서 유래한 mutant virus는 wild type과 비교하여 110~3,090배 높은 병원성을 보였다. MID₅₀의 경우, Balb/c에서 유래한 mutant virus들은 wild type과 비교하여 2,390~5,900배의 낮은 바이러스 농도에서도 더 높은 감염성을 보여주었다. 그러나 DBA/1J에서 유래한 mutant virus들은 wild type과 비교하여 165~422 배의 낮은 바이러스 농도에서 높은 감염성을 보였다. 혈액학적인 변화에서, 급성 염증반응의 마커로써 neutrophil이 Balb/c와 DBA/1J mutant virus 모두 비슷하게 상당히 증가했다. 그리고 생화학 검사 결과를 통해, Balb/c와 DBA/1J-adapted H3N2 인플루엔자 바이러스 마우스 모델에서 전체 중성지방과 콜레스테롤이 심각하게 줄어드는 것을 명확히 보여줬고, 이것은 바이러스 감염 후 분명한 체중감소에 기인한다. 그리고 전체 AST와 ALT의 양이 wild type과 비교하여 Balb/c와 DBA/1J-adapted H3N2 인플루엔자 바이러스 마우스 모델에서 상당히 높게 증가하였다. 조직검사를 통해서, 바이러스 감염 2일 후 폐와 기도 조직에서 병변이 명확하게 관찰되었고 두 조직의 병변 수준은 비슷하였으나 다른 조직들에서는 눈에 띄는 병변이 관찰되지 않았다.

결과적으로, Balb/c와 DBA/1J mouse-adapted H3N2 Influenza mutant virus는 마우스에서 lethality와 pathogenicity를 보이는 동시에 wild-와 mutant-H3N2를 백신 접종 후에 mouse-adapted Influenza mutant virus를 공격하였을 때, 성공적으로 mutant virus로부터 감염방어 효과를 확인하였다. 따라서 백신과 치료제를 평가할 수 있는 성공적인 마우스 인플루엔자 감염모델 시스템을 구축하였다.

3) 3^rd Year : Development of H3N2 (A/Incheon/1593/2015 and A/Hongkong/7127/2014) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity
3차년도에는 질병관리본부에서 제공한 두 종류의 바이러스[Influenza A virus H3N2(A/Incheon/1593/2015) 와 Influenza A virus H3N2 (A/Honkong/7127/2014)]를 가지고 1차년도 및 2차년도에 성공적으로 확보한 다양한 mouse adaptation 기술을 적용하여 mouse pathogenic한 Influenza virus 제조하고자 하였음. 그러나, 연구개발에 사용한 두 종류의 바이러스는 기존 방식과는 달리 ①초기 바이러스 감염원으로 사용하기 대량증식이 필요한데 사용한 MDCK 및 SIAT 세포주에서 바이러스의 증식이 거의 일어나지 않아 고 역가의 바이러스를 확보하기가 어려웠으며 ②또한, lung-cell-lung passage를 위해서 mouse의 lung infection을 통해 얻어진 Influenza virus가 포함된 lung lysate를 MDCK 및 SIAT 세포주에서 감염시켰을 때 immune clearance에 의해 매우 낮은 titer의 virus가 존재하여 세포내 virus 증식이 거의 일어나지 않아서 mouse adaptation을 위한 연속적인 passage 진행에 많은 어려움을 겪었다.

3차년도 실험내용 및 실험결과에서 보듯이 상기에 언급한 두 가지 근본적인 문제점으로 인해 가능한 다양한 접근방법을 사용하여 mouse passage를 진행하였으나 의미있는 임상증상 관찰,체중감소 현상 및 마우스 병원성 등의 특이적인 증상을 보이지 않아 mouse-adapted Influenza virus를 확보할 수 없었다. 그러나, 본 연구개발을 통해서 향후 효율적인 target cell line의 개발, 기존 세포주 내에서 Influenza virus의 낮은 감염성에 대한 원인 규명이 선행되어야 mouse pathogenic Influenza virus의 개발이 가능할 것으로 판단되었다.

( 출처 : 요약문 )

Abstract ▼

1) 1^st Year : Development of H3N2 (A/Victoria/361/2011) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity
Through the combination with lung-cell-lung and lung-to-lung passage to the inbred DBA/1J strain repeatedly for every 2 or 3 days, we were able to identify from DBA/1J with mouse pat

1) 1^st Year : Development of H3N2 (A/Victoria/361/2011) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity
Through the combination with lung-cell-lung and lung-to-lung passage to the inbred DBA/1J strain repeatedly for every 2 or 3 days, we were able to identify from DBA/1J with mouse pathogenicity which relates to increase of mortality rate and decrease of mortality period. A total of 4 clones were finally isolated from each lung homogenate of P14 and P19 through plaque purification and showed pathogenicity through the repeated confirmation test in DBA/1J mouse. It was then used to infect MDCK cell to gain mouse pathogenic virus and sent to the Influenza Virus Division at KCDC.

With DBA/1J mouse pathogenic virus clones, we have performed the RNA extraction, cDNA synthesis, and also created PCR product with specific primer of 8 genes. It’s been completed for gene sequence analysis with 8 genes. 11 to 16 amino acids substitution within 8 viral protein has been observed when compared Influenza virus of wild type with 4 mutant types. The location of amino acids substitution was irregular but numbers of substitution was similar with other previous results. Particularly major amino acids substitution has occurred from hemagglutinin(HA) which have effect on Influenza virus’s virulence and host range.

As a result of measurement for MLD₅₀, DBA/1J-adapted H3N2 Influenza mutant virus has been showed 37~850 fold higher virulence when comparing to wild type. In case of MID₅₀, DBA/1J-adapted H3N2 Influenza mutant virus has been showed higher infectivity under 70~33,000 fold lower virus concentration when comparing to wild type. Also we have investigated a hematological change in the mouse infected with DBA/1J-adapted H3N2 Influenza virus. As a result, it shows significant increase of neutrophil as a marker of acute inflammation. And through the serum chemistry analysis, it clearly shows that dramatical decrease in the total quantity of triglycerides in the mouse infected with DBA/1J-adapted H3N2 Influenza virus is due to mainly weight loss after virus infection. But, in this study we could not find a remarkable changes which has recognized as biomarkers during the test period after infection with mouse adapted-Influenza virus. Through the histopathology examination study, it has been clearly observed the lesion in lung and tracheal tissues from two days later after viral infection.

In conclusion, mouse-adapted H3N2 Influenza mutant virus shows pathogenicity and lethality in mouse. At the same time, when we have challenged mouse-adapted H3N2 Influenza mutant virus after vaccination with wild- and mutant-H3N2, it has been successfully protected from mutant virus. Therefore, we have established a good disease mouse model for the evaluation of vaccine and therapeutic agents.

2) 2^nd Year : Development of H3N2 (A/Switzerland/9715293/2013) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity
Through the combination with lung-cell-lung and lung-to-lung passage to the inbred Balb/c and DBA/1J strain repeatedly for every 2 or 3 days, we were able to identify from Balb/c and DBA/1J with mouse pathogenicity which relates to increase of mortality rate and decrease of mortality period. Passage 6, 8, 9 and passage 5, 9, 11, 12, 13 were selected from Balb/c and DBA/1J respectively. A total of 26 clones were isolated from each lung homogenate through plaque purification. It was then used to infect MDCK cell strain to gain mouse pathogenic virus. Amongst the 12 virus clones infected in Balb/c, 2 virus clones(P8_C2, P9_C2) showed high mouse pathogenicity as a result of the repeated confirmation test and were finally chosen for further analysis in Balb/c mice. Also, amongst the 14 virus clones infected in DBA/1J, 3 virus clones (P9_C1, P11_C2, P13_C1) also showed high mouse pathogenicity and were finally selected for further analysis in DBA/1J mice.

For gene sequencing and pathogenic analysis, totally 5 mutant virus clones derived from Balb/c and DBA/1J mice were chosen and used. With Balb/c(2 mutants) and DBA/1J(3 mutants) mouse pathogenic virus clones, we have performed the RNA extraction, cDNA synthesis, and also created PCR product with specific primer of 8 genes. It’s been completed for gene sequence analysis with 8 genes.

7 to 14 amino acids substitution within 5 viral protein excluding PB1, M and NS gene has been observed when compared Influenza virus of wild type with 5 mutant types. The location of amino acids substitution was irregular but numbers of substitution was similar with other previous results. When comparing the amino acids substitution of 5 viral proteins from Balb/c and DBA/1J derived mutant virus clones with wild type virus, most of the variations were observed from HA (4~6), NA (1~2), NP(1~2), PA(3~5) and PB2(1~2) of viral protein. Most of amino acids substitution has particularly occurred from Hemagglutinin(HA) and Nucleoprotein(NP) which has an effect on Influenza virus’s virulence and host range.
The location of amino acids substitution was irregular but numbers of substitution was also similar to other previous results.

By the results of MLD₅₀, Balb/c derived mutant viruses were showed 185~240 fold higher virulence compared to the wild type. But, incase of DBA/1J derived mutant viruses, it showed 110~3090 fold higher virulence compared to the wild type. In case of MID₅₀, Balb/c derived mutant viruses have been showed higher infectivity under 2,390~5,900 fold lower virus concentration when comparing to wild type. However, DBA/1J derived mutant viruses have been showed higher infectivity under 165~422 fold lower virus concentration when comparing to wild type. In hematological change, a significant increase in neutrophil as a maker for acute inflammation showed with similar degree in both Balb/c and DBA/1J mutant viruses. And through the serum chemistry analysis, it clearly shows that dramatical decrease in the total quantity of triglycerides and cholesterol in the mouse infected with Balb/c and DBA/1J-adapted H3N2 Influenza virus is due to mainly weight loss after virus infection. and also dramatical increase in the total quantity of AST and ALT was found in the mouse infected with Balb/c and DBA/1J-adapted H3N2 Influenza virus when comparing than those of wild type Influenza virus. Through the histopathology examination study, it has been clearly observed that the lesion in lung and tracheal tissues 2days after a viral infection and the level of lesion in both tissues were very similar. On the other hand, other tissues to be investigated did not show remarkable lesion.

In conclusion, mouse-adapted H3N2 Influenza mutant virus shows pathogenicity and lethality in mouse. At the same time, when we have challenged mouse-adapted H3N2 Influenza mutant virus after vaccination with wild- and mutant-H3N2, it has been successfully protected from mutant virus. Therefore, we have established a good disease mouse model for the evaluation of vaccine and therapeutic agents.

3) 3^rd Year : Development of H3N2 (A/Incheon/1593/2015 and A/Hongkong/7127/2014) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity

By applying various mouse adaptation techniques successfully secured during the 1st and 2nd year, our goal for the 3rd year was to produce mouse pathogenic Influenza virus using Influenza A virus H3N2 (A / Incheon / 1593/2015) and Influenza A virus H3N2 (A/Honkong/ 7127/2014), provided by the CDC(Centers for Disease Control & Prevention).

There were however obstacles in the process

① Mass-proliferation of the 2 viruses are needed to be used as early viral infection source.
However proliferation did not take place for MDCK and SIAT cell line and made it difficult to obtain high-activity viruses.

② In addition, when lung lysate containing Influenza virus obtained from lung infection of mouse for lung-cell-lung passage was infected in MDCK and SIAT cell line, very low titer virus existed due to immune clearance. Due to this factor virus proliferation was discouraged thus making it difficult to proceed with continuous passage for mouse adaptation

As shown in the experimental details and experimental results of the third year, due to the two fundamental problems mentioned above, the mouse-adapted Influenza virus could not be obtained. Although various possible approaches were used, no noticeable symptoms were observed (significant clinical signs, weight loss, mouse pathogenicity etc.). However, through this research and development, it was confirmed that development of an effective target cell line and identification of the cause of low infectivity of Influenza virus in the existing cell line are required to develop mouse pathogenic Influenza virus.

( 출처 : SUMMARY )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 학술연구개발용역과제 최종결과보고서 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구결과최종보고서 요약문 ... 4
• Summary ... 6
• 제1장 최종 목표 ... 8
• 1. 목표 ... 8
• 2. 목표달성도 및 관련분야에 대한 기여도 ... 14
• 제2장 국내외 기술 현황 ... 19
• 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 20
• 1. 인플루엔자 백신주 중 A(H3N2)형 바이러스에 대한 마우스 병원성주 개발 ... 20
• 2. 유전적 서열정보 분석 ... 25
• 3. Mouse-adapted H3N2 Influenza virus의 병원성 분석 ... 27
• 제4장 최종 연구 결과 ... 31
• 1차년도 연구 보고서 ... 31
• 2차년도 연구 보고서 ... 101
• 3차년도 연구 보고서 ... 182
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 244
• 1. 1차년도 : Development of H3N2 (A/Victoria/361/2011) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity ... 244
• 2. 2차년도 : Development of H3N2 (A/Switzerland/9715293/2013) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity ... 244
• 3. 3차년도 : Development of H3N2 (A/Incheon/1593/2015 and A/Hongkong/7127/2014) Influenza Virus Mutant with Mouse Pathogenicity ... 245
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 253
• 6.1 연구성과 ... 253
• 6.2 활용계획 ... 254
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 255
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 256
• 제9장 연구비 사용 내역 및 연구원 분담표 ... 257
• 9.1 연구비 사용 내역 ... 257
• 9.2 연구분담표 ... 258
• 제10장 참고문헌 ... 259
• 제11장 첨부서류 ... 261
• 1. 1차년도 인수기록지 ... 261
• 2. 2차년도 인수기록지 ... 262
• 3. 2차년도 인수기록지 ... 263
• 끝페이지 ... 264