초록 ▼

본 연구는 암세포나 바이러스 감염 세포 등 비정상세포에 대한 세포독성능이 뛰어난 Natural killer cell (NK세포)를 고효율로 체외 증폭할 수 있는 원천기술을 개발하고, 이 기술로 생산한 강력한 개 NK세포를 이용하여 궁극적으로 개 난치성 바이러스성질환을 극복하기 위한 효과적인 면역세포치료법을 확립하기 위하여 실시되었으며, 다음과 같은 결과를 도출하였다.
먼저 이 연구에서는 세계에서 최초로 강력한 항암, 항바이러스 효과를 갖는 개 NK세포의 체외 대량 증폭방법 개발에 성공하였으며, 그 결과에 대한 국내 및 국제 특

본 연구는 암세포나 바이러스 감염 세포 등 비정상세포에 대한 세포독성능이 뛰어난 Natural killer cell (NK세포)를 고효율로 체외 증폭할 수 있는 원천기술을 개발하고, 이 기술로 생산한 강력한 개 NK세포를 이용하여 궁극적으로 개 난치성 바이러스성질환을 극복하기 위한 효과적인 면역세포치료법을 확립하기 위하여 실시되었으며, 다음과 같은 결과를 도출하였다.
먼저 이 연구에서는 세계에서 최초로 강력한 항암, 항바이러스 효과를 갖는 개 NK세포의 체외 대량 증폭방법 개발에 성공하였으며, 그 결과에 대한 국내 및 국제 특허를 출원하였다 (출원번호: 10-2012-0005272, PCT/KR2013/000352). 개 NK세포의 체외 증폭방법을 개발하기 위하여 일차적으로 개의 말초혈액에서 과립구의 오염을 최소화하고 단핵세포 (단구 및 림프구)만을 순수 분리하기 위한 비연속성 밀도구배원심분리 방법을 확립하였으며, 배양 14일간 NK세포를 선택적으로 200배 이상 증폭하여 순도 95%이상 도달할 수 있는 증폭 조건을 확립하였고, 증폭된 세포들이 암세포와 바이러스 감염세포에 대해 강력한 자연살해 세포독성 능력을 가지고 있음을 증명하였다. 이 연구에서 확립한 방법을 이용해 선택적으로 증폭된 세포의 형태적, 유전적, 기능적인 특성을 밝혀 NK세포임을 증명한 결과들을 종합하여 수의학분야 상위 10% 내의 잡지에 게재하였다 (Shin et al - Ex vivo expansion of canine cytotoxic large granular lymphocytes exhibiting characteristics of natural killer cells. Veterinary Immunology and Immunopathology 2013;153:249-259).
바이러스 감염세포나 암세포 등 비정상세포에 대한 NK세포의 활성도를 평가하는데 있어 가장 중요한 평가 내용 중 하나인 세포독성능력을 평가하는데 51Cr을 이용한 51Cr release assay 가 표준방법으로 사용되고 있으나 방사선동위원소를 사용하여야하는 심각한 단점이 있다. 그래서 이 연구에서는 Calcein AM을 이용하여 이러한 문제를 개선한 더욱 안전하고 효과적인 세포독성능력 평가방법을 개발하였으며, 이 방법에 사용한 Calcein AM이 NK세포의 활성도에 전혀 영향을 미치지 않고 Cr release assay 방법과 동일한 결과를 산출해냄을 증명하여 이 방법의 유효성을 입증하여 그 결과를 국제 유수 잡지에 게재하였다 (Jang et al – An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving Calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical & Laboratory Science 2012;42(1):42-49).
체외 증폭된 강력한 개 NK세포의 항바이러스 효과를 확인하기 위하여 개에서 임상적으로 가장 문제가 되고 있는 canine distemper virus (CDV)를 Vero cell에 감염시킨 후 감염세포에 대한 NK세포의 세포독성능력을 확인한 결과 CDV에 감염된 Vero cell에 대한 세포독성능력이 현저히 증가함을 보여, 증폭된 NK세포가 CDV에 대한 강력한 항바이러스 효능을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 NK세포의 CDV감염세포에 대한 살상능력은 ADCC에 의해 증가하는 것이 확인되었으며, 특히 NK세포에서 분비한 Interferon-gamma(IFN-γ)가 CDV의 증식을 강력하게 억제함으로써 CDV에 대한 항바이러스 효능의 주 역할을 하는 것으로 확인되어 NK세포가 CDV감염에 대한 방어 기전에 깊이 관여한다는 사실을 밝혔다. 이상의 결과들을 종합하여 국제학술대회 (NK2012-13th Meeting of the Society for Natural Immunity)에 발표하였으며, 국제학술잡지에 투고 중에 있다.
이상의 체외 실험의 결과들을 토대로 증폭된 자가 NK세포의 임상적용을 위해 증폭된 세포를 생체에 주사하여 GVHD 등의 부작용 여부를 확인한 결과 주사 후 4주간 임상적인 부작용은 전혀 발생되지 않아 증폭된 자가 NK세포의 안전성이 확인되었으며, CDV를 감염시킨 개에 증폭된 자가 NK세포를 1주일 간격으로 3회 주사 (1X107 cells/kg) 한 개체에서 CDV억제 효과가 확인되어 임상적인 세포치료제로 사용 가능성이 입증되었다. 이상의 연구 결과를 종합하여 국제학술지에 투고할 예정이다.