초록 ▼

본 연구는 미래 바이오자원의 보고인 메타게놈을 신속하게 탐색하고 고부가가치 바이오촉매자원을 발굴 가능케 하는 기반 기술 개발을 목표로 다음과 같은 연구를 진행함.
● 기능유전체정보를 바탕으로 범용 메타게놈 라이브러리 숙주인 대장균의 스트레스반응을 규명하고, 재설계하며, T7 RNA 중합효소 및 T7 프로모터 도입에 의한 메타게놈 강제전사 도구를 개발하여 메타게놈 맞춤형 발현 호스트 및 벡터시스템 개발을 시도함.
● 메타게놈 유전자에 내재되어 있는 발현조절 정보가 발현숙주인 대장균에서 기능할 수 없거나, 타겟 단백질의 발현

본 연구는 미래 바이오자원의 보고인 메타게놈을 신속하게 탐색하고 고부가가치 바이오촉매자원을 발굴 가능케 하는 기반 기술 개발을 목표로 다음과 같은 연구를 진행함.
● 기능유전체정보를 바탕으로 범용 메타게놈 라이브러리 숙주인 대장균의 스트레스반응을 규명하고, 재설계하며, T7 RNA 중합효소 및 T7 프로모터 도입에 의한 메타게놈 강제전사 도구를 개발하여 메타게놈 맞춤형 발현 호스트 및 벡터시스템 개발을 시도함.
● 메타게놈 유전자에 내재되어 있는 발현조절 정보가 발현숙주인 대장균에서 기능할 수 없거나, 타겟 단백질의 발현에 특수한 발현조건이 필요하거나, 혹은 발현된 단백질의 특성상 숙주세포 내 발현이 어려운 메타게놈 유래 난발현 단백질 생산에 적용할 수 있는 무세포 단백질 발현기술을 개발함.
● 메타게놈 유래 효소가 극미량만 발현되어도 그 활성을 감지할 수 있는 고감도 유전자회로 프로그래밍 기술을 개발하여 신기능 효소 탐색에 적용함.
● 메타게놈 강제발현 시스템 개발: 다양한 메타게놈 유래 유전자의 발현을 유도할 수 있는 발현 카세트 및 트랜스포존 시스템을 개발하여 최적화하고 무세포 단백질 발현 시스템 및 유전자회로 기반 효소활성 탐색 기술과 연계하기 위한 조건을 수립함.
● 고효율 무세포 단백질 개량발현 기술: 메타게놈 유래 신규 효소의 활성이나 특성에 영향을 미치는 주요 아미노산 잔기 (hot-spots)를 고속으로 탐색하고 이를 조합적으로 변이시킴으로써 효소활성과 특성을 극대화 시킬 수 있는 고효율의 효소 개량 기술을 개발함.
● 메타게놈 효소탐색 합성생물학기술: 강제전사기술(FT: Forced Transcription)과 합성생물학적 효소탐색기술 (GESS: Genetic Enzyme Screening System)을 최적화하며 연계 기술을 개발하여 메타게놈 유래 효소 유전자 탐색효율을 극대화함. 나아가 실제 메타게놈 라이브러리 탐색을 통하여 개발 기술의 실효성을 입증하고 신규 유용효소를 발굴하여 자원화 함.
● 통합적 HTS 연계를 위한 발현 및 탐색기술: 강제발현 시스템, 무세포 개량발현, 효소탐색 기술을 통합적 HTS시스템으로 구현하기 위한 연계기술 및 운용 프로토콜을 개발함.

Abstract ▼

For high-throughput discovery of the high-value added novel biocatalysts from metagenome, the treasure of bio-resources for the future, we aim to develop a forced expression system, cell-free protein improvement and synthesis system, and synthetic biology based enzyme activity detection system. Furt

For high-throughput discovery of the high-value added novel biocatalysts from metagenome, the treasure of bio-resources for the future, we aim to develop a forced expression system, cell-free protein improvement and synthesis system, and synthetic biology based enzyme activity detection system. Further, we will develop an integrated system between the above mentioned techniques.
1. Development of E. coli strain for highly efficient expression of metagenome
To obtain a highly efficient soil metagenome library, we first optimized several steps such as the sample preparation, removal of humic substances, and cloning into fosmid vector. To understand the stress responses of E. coli cells upon construction of metagenomic library and to identify the putative engineering targets to develop better metagenome host, we carried out transcriptome profiling of E. coli strains upon introduction of low- and high-copy number metagenomic fosmid libraries. Furthermore, to remodel the genome of E. coli EPI300 metagenome library host, we constructed recombination systems based on suicide vector and recA and lambda recombinase and employed to delete the ompT and lon protease gene.
2. Development of techniques to maximize the expression of metagenome
We first constructed a lysogen carrying λDE3 which harbors T7 RNA polymerase and confirmed its operation by examining the inducible expression of a target gene cloned under the T7 promoter. To direct expression of metagenomic DNA, we employed transposon mediated random insertion of T7 promoter into fosmid library clone and induction in host expressing T7 RNA polymerase. In addition, we developed a bidirectional expression module which carries at both ends a T7 promoter sequence, multiple RBS, and initiation codons in three-frame to apply for construction of multi-fragment metagenome fosmid clones and expression vectors.
3. Improvement of cell-free protein synthesis system based on E. coli extracts
To reduce the production costs and time of the current cell-free protein synthesis system based on cell extracts of E. coli, we simplified the process for cell extract preparation and developed dual energy supply system by employing creatine phosphate and glucose. Moreover, we investigated the possibility to develop a new cell-free protein synthesis system by using the RNA polymerase of E. coli instead of T7 RNA polymerase.
4. Development of non-E. coli based cell-free protein synthesis system

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요 약 문 ... 4
• SUMMARY ... 8
• CONTENTS ... 11
• 목 차 ... 12
• 제 1장 연구개발과제의 개요 ... 13
• 제 2장 국내외 기술개발 현황 ... 20
• 제 3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 30
• 제 1절 메타게놈 고효율 발현 미생물 숙주 시스템 개발 ... 30
• 제 2절 연구개발의 목적 및 기대효과 ... 63
• 제 3절 대장균 기반 무세포 단백질 시스템의 개량 ... 77
• 제 4절 비대장균 유래의 무세포 단백질 생산 시스템의 구축 ... 84
• 제 5절 무세포 발현 시스템을 이용한 난발현 유전자 발현 ... 89
• 제 6절 극미량 효소활성 감지기술 개발 ... 102
• 제 7절 활성감지 유전자회로 이용 메타게놈 탐색 신기술 ... 110
• 제 8절 무세포발현시스템-유전자회로 연계 기술 개발 ... 124
• 제 9절 메타게놈 유전자 강제 발현 벡터시스템 개발 ... 127
• 제 10절 메타게놈 라이브러리 구축 ... 137
• 제 11절 메타게놈 유전자 강제 발현 시스템 ... 147
• 제 12절 유전자회로 이용 분자진화 연구 및 산업용 효소 개량 검증 ... 153
• 제 13절 FT-GESS기술의 최적화 연구 ... 159
• 제 14절 FT-GESS 연계기술의 적용을 위하여 메타게놈 유래 유용효소 탐색 ... 165
• 제 15절 효소의 활성부위 탐색을 위한 아미노산 scanning 기술 ... 171
• 제 16절 유전자 혹은 리보조옴의 고정화 기술 개발 ... 177
• 제 17절 변이된 효소 라이브러리의 초고속 발현 ... 181
• 제 4장 연구개발 목표 달성도 ... 184
• 제 5장 연구개발 결과의 활용계획 ... 192
• 제 6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 195
• 제 7장 참고문헌 ... 197