보고서 정보
주관연구기관 |
농림수산검역검사본부 |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2013-11 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201400001608 |
과제고유번호 |
1545006213 |
사업명 |
농림축산검역검사기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-08-16
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키워드 |
새우흰반점병바이러스.검역기술.PCR.real-time PCR.micro-array.White spot syndrome virus.single tube nested PCR.shrimp.VP19.VP28microarray.genotyping.
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초록
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5. 최종 연구결과 요약
◦세부과제명: 유전자증폭법 (PCR)을 이용한 새우흰반점바이러스병 (WSD) 진단법 개발
-WSSV 표준시료 도입 및 국내 WSSV 검사용 시료 확보
●영국, CEFAS의 표준 실험실로부터 WSSV 표준시료를 도입하였으며, OIE 매뉴얼방법을 사용하여 새우의 부속지 (pleopods)에서 WSSV 양성을 확인함
●베트남, 중국 등에서 국내로 수입되는 냉동 새우를 구입하여 검사용 시료를 확보하였으며, 미국으로부터 WSSV-free 새우 (post-larva)를 국내 도입함
-OIE
5. 최종 연구결과 요약
◦세부과제명: 유전자증폭법 (PCR)을 이용한 새우흰반점바이러스병 (WSD) 진단법 개발
-WSSV 표준시료 도입 및 국내 WSSV 검사용 시료 확보
●영국, CEFAS의 표준 실험실로부터 WSSV 표준시료를 도입하였으며, OIE 매뉴얼방법을 사용하여 새우의 부속지 (pleopods)에서 WSSV 양성을 확인함
●베트남, 중국 등에서 국내로 수입되는 냉동 새우를 구입하여 검사용 시료를 확보하였으며, 미국으로부터 WSSV-free 새우 (post-larva)를 국내 도입함
-OIE manual을 이용한 WSSV 검출법 확립 및 양성시료 확보
●WSSV 검출에 사용되는 OIE 매뉴얼 방법과 IQTMWSSV 검출 키트 (대만, OIE 인증제품)의 실험실 내 검출법 확립을 하고자 하였음
●OIE 매뉴얼 방법은 two-tube nested PCR 방식 (소요 시간 6시간)이며, IQTMWSSV 검출 키트는 single-tube nested PCR 방식 (소요시간 1시간 20분; 2차 증폭단계에 시약첨가)으로 WSSV 표준시료를 사용하여 실험실 내 검출법 확립함
●수입 냉동 시료 (새우·패류)에서 WSSV 검출을 위한 전처리 과정을 최적화하였으며, OIE 매뉴얼 방법을 이용하여 베트남·중국으로 부터 수입한 흰다리새우, 홍다리 얼룩새우에서 WSSV 양성을 확인함
-PCR법 개발 및 비교 분석
●WSSV 외피막 단백질을 암호화하고 있는 유전자인 VP19, VP28을 특이적으로 검출할 수 있는 primer를 제작하였으며, PCR 증폭반응 시 비특이 반응을 억제하고자 outer primer 3' 말단과 상보적으로 결합하는 antisense oligo를 제작함 (antisense PCR 적용)
●Single-tube nested PCR 방식으로 PCR 프로토콜을 최적화하여 반응 시간 단축 (1시간 30분) 및 실험실 내 교차오염을 방지할 수 있도록 함
●Primer, antisense oligo의 농도 조건을 확립하여 비 특이 증폭 산물생성의 최소화
●개발된 검출법의 민감도를 확인하고자, VP19·VP28 유전자를 함유하는 플라스미드를 이용하여 WSSV-free 새우 조직에 농도별 (1-105copy/mg) spike test를 실시한 결과, 1 copy/mg의 검출한계를 보임
●YHV, IHHNV 바이러스를 이용하여 개발된 WSSV 검출법에 적용한 결과 검출 특이성을 확인할 수 있었음
●개발된 WSSV 검출법은 OIE 매뉴얼법에 비해 10배 이상의 감도 차이와 PCR 반응 시간 절감(6시간→1시간 30분)에서 우수하였으며, IQTM2000 WSSV 검출 키트와 비교하여 10배 이상의 비용이 절감됨
-개발된 WSSV 검출법의 야외 시료에 대한 적용 및 유효성 비교 조사
●수입 냉동시료에 대한 적용 및 유효성 평가
:베트남·중국·필리핀 등에서 수입되는 냉동 시료 49건 (새우 42건, 이매패류 5건, 꽃게 2건)에 대해 개발된 WSSV 검출법의 적용 및 유효성 비교 조사를 실시함
:새우의 부속지 (pleopod), 패류의 아가미·중장선 및 꽃게의 흉지(pereopod) 조직을 사용하여 DNA를 추출하여 검출법 적용 및 검출법간 양성빈도 비교함
:개발한 PCR법의 양성율 (VP19, 57% VP28, 73%)이 기존의 방법(OIE 매뉴얼, 26.53% IQTM2000, 47%)에 비해 높게 나타났으며, 염기서열 분석을 통해 개발한 검출법의 유효성 확인
●국내 활 수산 동물에 대한 적용 및 평가
:서해안에서 서식 중인 갑각류 (3건), 패류 (7건), 복족류(1건)과 양식 새우(3건)을 이용하여 검출법을 적용 및 비교한 결과, 개발된 검출법의 VP19에서 9건, VP28에서 8건으로 WSSV 양성을 확인할 수 있었으며, OIE maanual 검출법 3건 및 IQ2000 kit 1건으로 본 연구에서 개발한 PCR법의 검출율이 현저히 우수함을 확인함
◦세부과제명: Microarray 기법을 이용한 WSSV 진단용 유전자 칩 개발
-WSSV 진단용 유전자 칩의 설계 및 개발
●WSSV 검출 유전자 부위 선정 및 특성 분석
:WSSV Taiwan(TW), Thailand(TH), China(CN), India(IN) 등 주요 strain 감별이 가능한 ORF14/15 부위를 선정
:ORF 14/15 부위는 각 strain 별로 유전자 deletion 크기 및 위치가 다른 것으로 알려졌으며, 이 부위에서 WSSV 검출 및 strain 정보를 획득할 수 있는 microarray 칩을 개발하고자 함
●WSSV 검출용 primer 제작 및 유효성 조사
:WSSV 검출 및 strain 구별을 위하여 ORF167와 ORF14/15 부위에서 프라이머를 제작
●WSSV에 특이적인 oligo 및 probe 설계
:증폭산물에 상보적인 올리고 제작, guanidine을 이용하여 probe고정
-개발 유전자 칩의 유효성 평가
●유전자 칩 제작 및 검출 최적조건 조사
:WSD 양/음성 판별 및 TH(Thailand), VN(Vietnam), IN-07(India-07, TW/CN (Taiwan/China), IN-05(India-05) 및 기타 strain 동시 감별 가능한 microarray 칩 설계하였으며, probe hybridization 최적화 프로토콜 확립함
:특이도를 확인하기 위하여 정밀검역에서 사용 중인 수산물 정밀 검역 검사 PCR 양성 샘플(plasmid)을 확보하여 microarray를 수행하였고, 결과 17종에 대해서 100% 특이도를 가지는 것을 확인.
:Microarray multiplex PCR의 민감도를 확인하기 위해 양성시료로 제작된 plasmid를 이용하여 검출감도 확인, 103.0 copy 까지 single multiplex PCR을 통해서 검출 확인
●표준 및 야외시료를 이용한 유전자 칩의 유효성 평가
:유전자 칩의 유효성을 평가하기 위하여 표준 실험실에서 도입한 WSSV 시료를 표준시료로 사용하였음
:그리고 WSSV strain별 VR14/15와 새우 16S rRNA plasmid를 제조하여 plasmid mix 양성시료로 사용하였으며, 수입 냉동 새우 및 국내 양식 새우 시료를 야외시료로 사용함
:표준 시료를 이용한 유전자 칩의 유효성 평가 결과 TH type으로 확인되었으며 염기서열 분석 결과와도 일치함
:국내 양식 새우와 수입 냉동 새우 시료에서 TW, IN-05 strain을 확인함
●진단 판정 기준 설정
:Macro를 제작하여 microarray 결과 값을 적용 시 strain에 대한 정보를 바로 얻을 수 있는 시스템을 작성하였고 이를 바탕으로 표준 및 야외 시료를 적용하여 실험을 수행한 결과, sequencing으로 그 strain이 확인되었던 시료들에 대해서 동일한 결과를 얻을 수 있었음
Abstract
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White spot syndrome virus (WSSV) is a double-stranded DNA virus that causes severe mortality, leading to great economic loss for cultured shrimp farms. The Manual for Aquatic Animals published by the Office International des Epizooties (OIE, 2012) announced the nested PCR protocol, developed by Lo e
White spot syndrome virus (WSSV) is a double-stranded DNA virus that causes severe mortality, leading to great economic loss for cultured shrimp farms. The Manual for Aquatic Animals published by the Office International des Epizooties (OIE, 2012) announced the nested PCR protocol, developed by Lo et al. in 1996 as the standard protocol for WSSV diagnosis.
Because current detection tools are prone to carryover contamination and are labor-intensive, an accurate and convenient technique is required. Therefore, the aim of this study was to develop an improved diagnostic PCR method for WSSV that overcomes the known drawbacks of the conventional PCR method. We designed primers directed toward the nucleotide sequence encoding envelope proteins of WSSV, VP19 and VP28. By applying an antisense oligonucleotide technique, we converted this PCR assay into a non-stop one-tube system, subsequently enabling a faster and more sensible PCR assay. In practice, the newly developed protocol detected the WSSV genome from imported frozen shrimps, crabs and bivalves, with a shorter PCR running time and a higher sensitivity compared with other PCR methods.
White spot syndrome virus (WSSV) was a causative agent of white spot disease (WSD) world wide spread through the seawater. The WSSV is double stranded DNA virus belongs to Nimaviridae, Whispovirus. The WSD was first reported in northeast Asia and is the major cause of large economic losses on shrimp farming. The WSSV infection shows a mortality of up to 100% within 3~10days. The WSSV has a wide host range that extends to not only most shrimp species but also many other crustace an including gcrayfish, crab, and lobster. Current diagnostic methods of the WSSV were clinical signs observation, antibody-based diagnosisassays, and molecular diagnostic techniques. The IQ2000TM WSSV detection and prevention kit was certified from the OIE and composed of DNA purification and PCR reagents. But the kit was highly expensive and required a considerable amount of diagnosis time. Microarray was effective technique to detect multiple targets as a single assay.
ORF14/15 of WSSV has large deletion site that was different pattern each of strains. Here, we were focused on the detection and strain typing of WSSV using the newly developed microarray.
Frozen shrimps were purchased from markets. DNA was extracted from the pleopod of shrimps using viral gene spin DNA/RNA extraction kit (Intron, Korea). The WSSV was detected according to the OIE manual’s PCR methods. ORF14/15 amplification was performed with VR14/15-screen primer set. The virus in samples imported from Thailand (TH), Taiwan (TW) and India (IN) were detected and its strain typing was determined using sequence analysis. The primers for the strain typing were designed based on the deletion region of ORF14/15. The primers were tagged the Cy5. PCR reaction was followed 40 cycles of 94℃ for 30 sec, 55℃ for 30 sec and 72℃ for 40 sec and final extension step for 5 min at 72℃.
Microarray chip was made from MEDIAN Diagnostics (Korea) by order production. PCR product was reacted on microarray chip during 1 hour at 48℃. After one hour, the chip was washed 2 times with washing buffer and the results were identified with Luxscan 10K (Biocapital, China).
The positive result of WSSV microarray accorded with sequence analysis. For the specificity of microarray, we were tested with other positive control DNA of 17 agents received from the Development of Quarantine Inspection in National fisheries Quarantine Service. The results showed no cross reactivity with other aquatic disease. The microarray developed in this study was estimated as a suitable application method for the diagnosis of WSSV.
목차 Contents
- 총괄요약표 ... 1
- 연구과제 최종결과보고서 ... 4
- Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
- Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 6
- Ⅲ. 연구결과 ... 7
- Ⅳ. 연구결과요약 ... 21
- Ⅴ. 고 찰 ... 22
- Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 23
- Ⅶ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 24
- Ⅷ. 주요연구과제 변경사항 ... 24
- IX. 참고자료 ... 24
- X. 영문초록 ... 26
- 끝페이지 ... 27
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