[보고서]간암 진행과 관련된 유전자 및 신호전달체계 연구: 표적치료를 중심으로

[국가R&D연구보고서] 간암 진행과 관련된 유전자 및 신호전달체계 연구: 표적치료를 중심으로
Identification of signaling pathway and novel target gene in human hepatocarcinogenesis of progression: focused on molecularly targeted therapy 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	국립암센터 National Cancer Center
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2013-10
과제시작연도	2013
주관부처	보건복지부 [Ministry of Health & Welfare(MW)(MW)
연구관리전문기관	국립암센터 National Cancer Center
등록번호	TRKO201400002942
과제고유번호	1465014811
사업명	암연구소및국가암관리사업본부운영(구.국립암연구소운영)
DB 구축일자	2014-04-19
키워드	간세포암종.진행.전이.표적 유전자.세포신호전달.아바타 동물모델.소라페닙.DDR2.NGS.hepatocelluar carcinoma.progression.metastasis.target gene.signal pathway.Avatar mouse model.NGS.sorafenib .
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201400002942

초록 ▼

연구목표
<최종목표>
- 간암의 진행과 예후 등에 관계되는 유전자와 세포신호전달체계를 표적치료 중심으로 발굴
- 발굴된 유전자를 이용한 간암 치료 반응 및 예후 예측: 호의적 반응 환자 선택기준 개발
- 간암 치료를 위한 새로운 후보 표적유전자 및 신호전달체계 발굴
<당해연도목표>
1. 간세포암종 세포주 동물 모델에서 DDR2 종양억제 기전 확립
2. 사람 간세포암종 수술 조직을 사용한 동물 모델 확립 후 사람 간세포암종 동물 모델을 사용한 DDR2의 종양 억제 효과 검증
3. 간세포암종 환자에서 표적치료 효과 증대 연구: 반응과 관련된 유전자 변형 및 유전체 특성 규명
연구내용 및 방법
1) Downregulation of discoidin domain receptor 2 decreases tumor growth of hepatocellular carcinoma
- 국내외 처음으로 DDR2 발현이 간세포암종의 성장과 관계된다는 것을 in vitro 및 in vivo 연구로서 규명
2) 간내 담관세포암종에서 DDR2 발현 의미와 종양억제 기전 연구
- 간세포암종과 달리 DDR2 발현 억제로써 담관세포암종 성장 억제가 일어나지 않음. negative result를 얻음.
3) 간세포암종 환자 수술조직을 사용한 마우스 Avatar 모델 확립
- 우리나라에서 처음으로 간세포암종 환자조직을 사용한 마우스 아바타모델을 확립함.
4) 간세포암종 마우스 아바타 모델 활용
- 마우스 아바타 모델 제조 과정서 관찰되는 조직의 침습성, 악화도 상승의 원인을 규명함으로써 hepatocarcinogenesis의 한 기전을 밝힐 수 있었음.
5) 간세포암종 환자에서 Sorafenib 치료 반응과 관련된 유전자 특성 규명
- 아직까지 소라페닙 치료 반응과 관련된 유전자 규명이 없는 상태에서 국내외 처음으로 소라페닙 반응과 연관된 약물관련 유전자 특성을 밝히고, 환자 코호트를 통해 validation을 함. 특허 출원 중
6) Clinical outcomes of a cohort series of patients with hepatocellular carcinoma in a hepatitis B virus-endemic area
- 국립암센터 간암센터에서 연구자에 의해 구축해온 환자 코호트로부터 2004년부터 2009년까지 처음으로 간세포암종을 진단받았던 환자 1972명 추출하여 전반적인 임상상과 치료 양상, 각각의 치료 결과, 예후 인자 및 생존율 등을 광범위하게 조사함.
7) Validation of a Model to Estimate Survival in Ambulatory Patients with Hepatocellular Carcinoma: A Single-Center Cohort Study
- 본 연구자가 발표했었던 2000-2003년 국립암센터 간암센터 코호트를 미국 메이요 클리닉 환자 자료와 비교하여 새롭게 만들어낸 예후 예측 시스템인 MESIAH(a Model to Estimate Survival in Ambulatory Patients with Hepatocellular Carcinoma; Hepatology 2012)를 새로 구축한 2004-2009년 코호트에서 그 가치를 재 증명함.
8) Long-term outcomes of second treatment after initial transarterial chemoembolization in patients with hepatocellular carcinoma
- 색전술 후 2차 치료 양상을 조사하고 그 치료 결과와 생존율 등을 국내외 처음으로 보고함.
연구개발에 따른 기대성과
<정량적 성과>
1) 총연구기간 내 목표연구성과로 기 제출한 값
<정성적 성과>
- DDR2가 간세포암종 성장과 관련된다는 것을 국내외 처음으로 밝히고 새로운 표적치료제 후보물질로서 가능성을 제시
- 우리나라 처음으로 간세포암종 환자조직을 사용한 마우스 아바타모델을 확립하여 향후 연구의 큰 발판을 마련함.
- 소라페닙 치료반응과 연관된 환자 약물반응 유전자를 국내외 최초로 밝혀 특허출원 중

Abstract ▼

Objective: To find novel signal pathways and genes assocaited with progression and prognosis of hepatocellular carcinoma (HCC) to analysis the association between novel molecules and treatment response/prognosis of HCC through the analysis of clinical cohort to find novel target molecule or gene for HCC therapy.
Methods: Clinical data evaluation, translational research and development of mouse Avatar model.
Results: 1) We found that downregulation of discoidin domain receptor 2 decreases tumor growth of HCC, which was not found in cholangiocarcinoma cells.
2) We established a mouse Avatar model generated from patients with HCC.
3) Through the next generation sequencing on the peripheral blood leucocytes from patients with HCC who treated with sorafenib, we observed novel genomic variations, which may prove a important for identifying HCC patients whose genotypes could serve as predictive biomarkers of the response to sorafenib treatment.
4) We investigated the patterns and long-term outcomes of second treatments in a cohort of HCC patients with RPRT after initial TACE; these results are expected to provide useful information for formulating treatment strategies for HCC.
5) We analyzed the survival outcomes of the longitudinal cohort study from 2004 to 2009.
6) We validated the new prognostication model MESIAH by the new cohort of National Cancer Center, Korea.
Conclusion: We observed a novel molecule and gene associated with prognosis of HCC and/or sorafenib treatement.

목차 Contents

기관고유연구사업 최종보고서 ... 1
목차 ... 3
요약문 ... 4
Project Summary ... 6
1. 연구의 최종목표 ... 7
2. 연구의 내용 및 결과 ... 7
3. 연구결과 고찰 및 결론 ... 44
1) Downregulation of discoidin domain receptor 2 decreases tumor growth of hepatocellular carcinoma ... 44
2) 간내 담관세포암종에서 DDR2 발현 의미와 종양억제 기전 연구 ... 44
3) 간세포암종 환자 수술조직을 사용한 마우스 Avatar 모델 확립 ... 44
4) 간세포암종 마우스 아바타 모델 활용 ... 44
5) 간세포암종 환자에서 Sorafenib 치료 반응과 관련된 유전자 특성 규명 ... 45
6) Clinical outcomes of a cohort series of patients with hepatocellular carcinoma in a hepatitis B virus-endemic area ... 45
7) Validation of a Model to Estimate Survival in Ambulatory Patients with Hepatocellular Carcinoma: A Single-Center Cohort Study ... 45
8) Long-term outcomes of second treatment after initial transarterial chemoembolization in patients with hepatocellular carcinoma ... 46
4. 연구성과 및 목표달성도 ... 46
(1) 연구성과 ... 46
(2) 목표달성도 ... 61
5. 연구결과의 활용계획 ... 63
(1) 연구종료 2년후 예상 연구성과 ... 63
(2) 연구성과의 활용계획 ... 63
6. 참고문헌 ... 64
7. 첨부서류 ... 75
끝페이지 ... 75

표/그림 (17)

표 Human HCC in cell lines and patient tissues show DDR2 expression. (A) All of the examined human HCC cell lines expressed DDR2 mRNA, whereby SNU387, SNU423, and SNU449 cells expressed relatively larger amounts of DDR2 mRNA. The entire control group also expressed DDR2 mRNA. (B) All HCC tissues isolated from the five patients with HCC demonstrated DDR2 mRNA expression. While DDR2 expression was more prominent in the HCC tumor compared to the surrounding tissue in three patients, one patient (patient No. 3) showed a reversed pattern of expression. (C) Immunohistochemical staining with anti-DDR2 antibody (b) or without anti-DDR2 antibody (a) in an HCC specimen (trabecular and pseudoglandular type, Edmondson and Steiner’s histologic grade 3, underlying cirrhosis) from a patient showing patchy cytoplasmic or membranous positivity for DDR2. Black arrows indicate the presence of DDR2 at the membrane and in the cytoplasm ; (c) immunohistochemical staining with anti-DDR2 antibody in an normal liver specimen (normal control) showing no stain of hepatocyte and positive stain of bile duct epithelium.
표 DDR2 siRNA inhibits proliferation of human HCC cells in vitro. Transfection of DDR2 siRNA significantly inhibits cell growth of Hep3B, SNU387, SNU182, and PLC/PRF5 compared to cells with non-target siRNA transfection (P < 0.001). DDR2 siRNA also significantly inhibits cell growth of MCF-7 (P < 0.05).
표 Intratumoral injection of DDR2 siRNA inhibits tumor growth in HCC xenograft model. DDR2 siRNA or non-target siRNA was injected into the tumors on scheduled days for 6 times (1, 4, 6, 8, 10, and 12 days). (a) There was a significant difference in average tumor volumes between the DDR2 siRNA-treated group and the non-target siRNA-treated group at 12 days and at 14 days after the injection (P < 0.05) in SNU182 xenograft mice. DDR2 siRNA injection decreased the mean tumor volume by 65.6% compared to that of the control. (b) Hep3B xenograft mice did not demonstrate any significant difference in tumor growth after DDR2 siRNA or non-target injection. (c) Negative control, HeLa cells showed no differences in average tumor volume between DDR2 siRNA and control injection. (d) At the end of study, harvested tumor tissues from the sacrificed mice demonstrated suppressed expression of DDR2 protein by DDR2 siRNA in Western blot (upper) and in immunohistochemical staining with anti-DDR2 antibody (lower). (e) Histology (H&E stain) of SNU182 and Hep3B xenograft tumors in non-treatment (control), after non-target siRNA treatment, and after DDR2 siRNA treatment showed a change of tumor tissue.
표 The mechanism involved in the DDR2 siRNA-induced inhibition of SNU182 tumor growth. (A) Expression of DDR2 in SNU182 cells was completely abrogated after 72 h of DDR2 siRNA treatment, and was not affected by non-target siRNA or PBS control. (B) The apoptosis analysis demonstrated that DDR2 siRNA treatment significantly increased apoptotic cells (P < 0.01). (C) Cell migration was significantly inhibited by DDR2 siRNA treatment (P < 0.05). (D) Cell invasion was dramatically decreased by DDR2 siRNA treatment, in comparison with non-target siRNA treatment or PBS control (P < 0.01).
표 Cholangiocarcinoma(CCA)와 Hepatocytocarcinoma(HCC)에서 DDR2의 발현. RT-PCR으로 확인한 mRNA expression(A), Western blot을 이용한 protein expression(B)
표 KMCH cell-line에서 DDR2 siRNA의 단백질 억제 효과 증명 (Western blot)
표 DDR2 siRNA 처리에 의한 세포 증식 억제. siRNA Transfection 후 96시간 배양했을 때 세포 사진(40배율, Olympus)(A), Collagen coating 유무에 따른 DDR2 siRNA의 세포 증식 억제 효과(B) DDR2 depletion
표 DDR2 감소에 따른 세포 이동 및 침윤 저해 효과. Migration assay를 이용한 세포 이동의 변화(A), Invasion assay를 통한 세포 침윤의 현저한 차이(B)를 관찰 하였다.
표 DDR2의 감소에 의한 cell cycle 및 apoptosis의 유도. PI staining을 이용한 cell cycle 분석 (A), AnnexinV-PI staining을 이용한 apoptosis 분석(B)
표 KMCH xenografts model에서 DDR2 siRNA의 injection에 의한 tumor growth 억제 효과. Non-target siRNA 및 DDR2 siRNA를 총 5회 intratumoral injection 하고 end-point(10day)에 mouse 사진과 적출한 tumor tissue 사진(A), 2일마다(0, 2, 4, 6, 8, 10day) tumor volume(B-left)과 mouse body weight(B-right)를 측정한 결과(B)
표 clinical and pathological characteristics of human primary HCC specimens
표 Tumorgrafts arising from human HCC specimens Representative H histologic characteristics of Avatars are similar to the source tumors of patient.
표 Cryopreservation of tumorgraft tissue
표 Inhibition of tumor growth by DDR2 siRNA and Sorafenib Mice bearing tumors were treated with DDR2 siRNA or non-target siRNA for 16 days (Day 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, and 14).There was a significant difference in average tumor volumes between the DDR2 siRNA-treated group and the non-target siRNA-treated group at 16 days after the injection in xenograft mice. DDR2 siRNA injection decreased the mean tumor volume compared to that of the non-target siRNA. Mice bearing tumors were treated with vehicle or Sorafenib(50mg/kg) daily for 16 days. There was a significant difference in average tumor volumes between Sorafenib treated group and the vehicle-treated group. There was not a significant difference in body weight.
표 Schematics of eight non-synonymous SNVs located in 5 genes Schematics of eight non-synonymous SNVs located in five genes (MUSK, ABCB1, ALDH3B1, FMO3, and SLC15A2), illustrated with functional domains (arrows indicate the locations of variants; numbers indicate the position of amino acids.)
표 Kaplan-Meier plot depicting the progression-free survival of the validation cohort according to the ****** genotype Progression-free survival was significantly longer for patients with C/C genotype compared with those with C/T or T/T genotypes (HR, 2.46; 95% CI, 1.36.4.44; P = 0.003).
표 a. Baseline demographic and clinical characteristics of enrolled patients (n = 7)

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